实验室诊断是羊病综合诊断的重要诊断方法之一,是疾病确诊的重要手段。经临床检查、病理剖检以后,根据已获得的资料和症状,还不足以做出明确的诊断时,就需要拟定必要的实验室诊断方案,进一步选择并实施某些辅助或特殊的实验室诊断项目和内容。实验室诊断的主要内容包括病料的采集、保存、包装和运送,血、尿、粪的常规检验及生化分析,脑脊液、胸、腹腔液的检验,肝、肾功能试验,X线检查,超声波检查,心电描记,细菌学检查(如细菌形态学检查、细菌的分离培养与生化鉴定、细菌对药物的敏感试验),病毒学检查(病毒的分离与鉴定、包涵体检查、电镜技术),血清学试验(如凝集试验、直接凝集试验、中和试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析诊断技术),寄生虫学检查(粪便寄生虫检查、血液寄生虫检查、皮肤寄生虫检查、虫卵和卵囊计数法)和毒物检验等内容。
(一)病料的采集、保存、包装和送检
1.病料采集 采集病料前对所用的刀、剪、镊子、注射器、针头等应预先消毒处理,金属器械使用前要在火焰上烧一下;玻璃器皿用高压灭菌;软木塞、橡皮塞置于0.5%石炭酸水溶液或1%碳酸钠水溶液中煮沸消毒10分钟左右。每采集一种病料,使用一套器械或容器,互相不能混用。
采集病料时,不同疾病采集的病料不同,如口蹄疫、水疱病等取水疱皮和水疱液,狂犬病、伪狂犬病等取脑部。原则上要求采集病原微生物含量多、病变明显的部位,同时易于采集、保存和运送。如果临床缺乏资料,剖检时又难以分析判断可能属于哪一种病时,应比较全面地取材,如脑、血液、肝、脾、肺、肾和淋巴结,同时要注意带有病变的部分。如果怀疑炭疽除非必要时不准做尸体剖检,割取一只耳朵就可以了。尽量无菌采集,而且操作必须迅速,特别是在炎热的夏季。
2.病料保存 病料采集后,如不能立即检验或需送有关单位检验,应当加入适量保存剂,使其尽量保持新鲜状态。 细菌检验所采集的脏器、组织一般可用灭菌的30%甘油缓冲液或灭菌的液体石蜡保存,液体病料可装入封闭的毛细玻璃管或试管中;病毒一般保存于灭菌的50%甘油缓冲盐水液检验材料中或灭菌鸡蛋生理盐水内;血清学检验固体病料如小块肠、耳、脾、肝、肾、皮肤材料等,可用硼酸或食盐处理,血清可在每毫升中加5%石炭酸1滴;病理组织学检验将病料立即放入10%福尔马林或95%乙醇中固定,任何一种固定液的用量均须为标本体积的10倍以上,如用10%福尔马林溶液固定,应在24小时后换新鲜溶液1次。脑、脊髓组织须用10%中性福尔马林溶液固定。为了防止严寒季节组织冻结,在送检时可将上述固定好的组织块保存于甘油和10%福尔马林等量混合液中。
3.病料的包装 病料包装要求安全稳妥,病原学检查的材料应放入加有冰块的保温瓶内送检。包装好的病料应尽快由专人送检。
4.病料的送检 送检病料必须附有说明,其内容包括:送检单位及地址,病羊品种、性别、年龄、发病日期、死亡时间、取材时间,病料名称及序号,病料中加入何种保存液,主要临床症状,病理剖检变化,曾经进行何种治疗及该疫病的流行情况等,并提出送检的目的和要求,将盛有病料的容器加盖加塞,并用蜡封闭严密。
(二)实验室检验
1.血液检查 通常是采取瑞氏染色或姬姆萨染色,于显微镜下检查。先用低倍镜检查,再用高倍镜和油镜检查。
2.病理组织检查 无菌采集病变组织制作成触片,然后染色、镜检,或制成病理组织切片经显微镜检查。
3.病原微生物检查
(1)细菌学检验。
1)涂片镜检:将病料涂于清洁无油污的载玻片上,干燥后在酒精灯火焰上固定,选用单染色法(如美蓝染色法)、革兰氏染色法、抗酸染色法或其他特殊染色法染色镜检,根据所观察到的细菌形态特征,做出初步判断或确定进一步检验的步骤。
2)分离培养:根据所怀疑传染病病原菌的特点,将病料接种于适宜的细菌培养基上,在一定温度(常为37 ℃)下进行培养,获得纯培养物后,再用特殊的培养基培养,进行细菌的形态学、培养特征、生化特性、致病力和抗原特性鉴定。
3)动物试验:用灭菌生理盐水将病料做成1∶10的悬液,或利用分离培养获得的细菌液感染试验羊。感染方法可用皮下、肌内、腹腔、静脉或脑内注射。感染后按常规隔离饲养管理,注意观察,有时还须对试验羊测量体温,如有死亡,应立即进行剖检及细菌学检查。
(2)病毒学检验。无菌取出病料组织,用磷酸缓冲液反复洗涤。然后将组织剪碎、研细,加磷酸缓冲液制成1∶10悬浮液(血液或渗出液可直接制成1∶10悬浮液),经离心沉淀取出上清液,每毫升加入青霉素和链霉素各100单位,置冰箱中备用。把样品接种到鸡胚或细胞培养物上进行培养。对分离到的病毒,用电子显微镜检查,并用血清学试验及动物试验等方法进行物理学和生物学特性的鉴定。或将待检样品经分离培养得到的病毒液接种易感动物。
常用的方法有凝集反应、沉淀反应、补体结合反应、免疫学检验反应、中和试验等血清学检验方法,以及用于某些传染病生前诊断的变态反应等。目前较先进的方法有免疫扩散、荧光抗体技术、酶标记技术、单克隆抗体技术和PCR技术等。