第十节 血清学诊断

一、血清学反应概述

(一)血清学反应的概念及一般特点

抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反应。

血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：

1.特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定簇的组成、结构以及排列不同，所诱导产生的抗体也不同。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。

生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。

2. 结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60℃或pH值降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性，可进行免疫吸附层析，纯化抗原或抗体。

3. 最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体的结合物的未饱和点相连接，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。

如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。

抗原过多，造成前带现象，抗体过多，造成后带现象。

4. 反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒至几分钟即完成，但无可见反应;第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。

5.影响反应的因素

(1)电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%～10%高渗盐水稀释，才出现较强反应。

(2)温度 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置37℃温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应;温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用的低温中放置过夜。

(3)酸碱度 血清学反应通常用pH值为6～8，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。

因为抗原抗体反应结果受多因素影响，为了证实试验的准确性，故在试验中一定要设立阳性、阴性和空白对照

(二)血清学反应的应用方式和目的

抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体;诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原(病原)，如炭疽病等。

1. 抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原(细菌、病毒)的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便地确诊抗原或抗体。

2. 生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。

3.抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机制的探讨。

4.微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组分进行分析。

5. 血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、Coomb实验等技术，可做血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。

二、凝集试验

细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，这种试验称为凝集试验。

参与反应的抗原叫凝集原;参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集试验可分为直接凝集试验、间接凝集试验。

(一)直接凝集试验

颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。

1. 玻片凝集试验 该方法主要用于定性试验。用已知抗体(诊断血清)检测未知抗原，如细菌的鉴定或分型，血型的鉴定等。相反，用已知诊断抗原可检测血清中的相应抗体，如鸡白痢检疫等。

将已知的抗血清1～2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液(抗原)加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。

简单、快速。如用已知的沙门菌血清，鉴定沙门杆菌的抗原组分以定型。此法也用于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫。

2. 试管凝集试验 该方法用于定量试验，以确定血清中相应抗体的凝集价。是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列试管，将待检血清用0.5%石炭酸生理盐水做10倍递进稀释，每管维持量为0.5ml，一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度的抗原0.5ml，混合均匀，在37℃或室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同的凝集程度记录为“++++”(100%菌体凝集)、“+++”(75%凝集)、“++”(50%凝集)、“+”(25%凝集)、“-”(0%凝集)。

凡能与一定量抗原发生50%凝集的血清最高稀释度，为血清的凝集价或效价(滴度)。在试验时，必须建立阴性、阳性血清对照管。

准确、耗时。如诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价(定量)。

(二)间接血凝试验

间接凝集试验是将可溶性抗原吸附于某些载体表面，在电解质存在条件下，这些吸附抗原的载体颗粒与相应抗体发生凝集反应。由于是抗原与相应抗体的结合使载体颗粒发生凝集，故称为间接凝集，又称为被动凝集。红细胞是一种常用的抗原载体。用红细胞作抗原载体的凝集反应称间接血凝试验。

红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3d。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融不破碎，在4℃可保存3～6个月，在-20℃可保存1年以上。

致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持良好的免疫活性。用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只需在低pH值，低离子浓度下，用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺和氯化铬，前者通过共价键，后者通过金属阳离子静电作用使蛋白质与红细胞表面结合而达到致敏的目的。

1. 正向间接凝集试验 将抗原吸附或偶联到载体颗粒上，测定被检抗体，称为正向间接凝集试验。

2.反向间接凝集试验 将抗体吸附或偶联到载体颗粒上，测定被检抗原，称为反向间接凝集试验。

3. 间接凝集抑制试验 将可溶性抗原先与相应抗体混合，然后加入抗原致敏的载体颗粒，由于抗体已与可溶性抗原结合，故不能再与致敏载体颗粒发生凝集，故称为间接凝集抑制试验。反应时，不发生凝集者为阳性，发生凝集者为阴性。

除红细胞外，聚苯乙烯乳胶、活性炭、皂土等，也可用作可溶性抗原的载体，其试验可分别以载体命名，即胶乳凝集试验，碳素凝集试验，皂土凝集试验等。

(三)抗球蛋白试验

抗球蛋白试验系Coombs等首先创立，故又称Coombs试验。试验主要用于测定单价抗体(不完全抗体)。在正常凝集试验时，应用本法可提高其敏感度。单价抗体与颗粒抗原相结合，不出现可见的凝集反应，但该抗原表面决定簇已被单价抗体所封闭，不能与相应的完全抗体相结合而发生凝集现象，故谓之阻断试验。阻断试验特异性不高，故很少使用，现多用抗球蛋白试验。由于抗体本身就是一种良好的抗原，用该动物的正常免疫球蛋白免疫异种动物，可获得抗球蛋白的抗体。抗球蛋白的抗体与已吸附单价抗体的颗粒抗原相结合，即可发生凝集，其实质也是一种间接凝集。本法用于布氏杆菌单价抗体的检测。

三、沉淀试验

可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验。参加沉淀反应的抗原，称为沉淀原;参加沉淀反应的抗体，称为沉淀素。尤其适用于病毒性传染病的诊断。

(一)环状沉淀试验

将已知血清加入小试管内，然后将待检抗原加于血清表面，成为分界清晰的两层，数分钟后两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应，该试验主要用于抗原检测的定性试验，如炭疽病的诊断试验等。

(二)絮状沉淀试验

抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。

(三)琼脂扩散试验

琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85 nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散(抗原或抗体中一种成分扩散)和双扩散。

琼脂扩散试验具有操作简便、特异性强、敏感性较高的优点，广泛应用于细菌、病毒的鉴定以及传染病的诊断方面。根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。

1. 单向单扩散 将0.6%～1%琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37℃中，2 ～3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。

2. 单向双扩散 基本做法同单向单扩散法，但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。

3. 双向单扩散 在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清[用1：(5～10)倍稀释]，混合后倒入平皿或玻板上，厚2～3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2～3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37℃下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。

4. 双向琼脂扩散(琼扩) 把放凉到50～60℃的凝胶小心地倒在平皿内，使成约5mm厚的琼脂层即为凝胶平板。制凝胶平板时尽量一次倒成，使表面平整，厚薄均匀。待琼脂层凝固后，以直径5mm的打孔器在琼脂平板上打孔，使梅花状分布，周孔距中央孔5mm。打孔后，用尖头镊子或解剖针挑出孔中的琼脂块。将平板在酒精灯上不停转动，适当加热，使底部凝胶溶化，封闭孔底即成。

将平板上各孔编号。用移液管吸取抗原注入中央孔内;然后向周围四孔分别加入待检血清;留下二孔分别加标准阳性和阴性血清。各孔滴加量以加满但不溢出为宜。放置湿盒中，在37℃湿箱中24～72h后观察。在抗原孔与检血清孔之间出现白色沉淀线者为阳性反应，无沉淀线者为阴性反应。

如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合;抗原则不同，则互相交叉;部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉。

常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。

(四)免疫电泳

琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，故其迁移率不同，因而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。

1. 微量免疫电泳 用pH值8.6的巴比妥缓冲液(VB液)配成1%的琼脂液，制成凝胶板。在凝胶板1/3处打孔2个，孔径2～3mm，两孔间距10～12mm。孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳45～120min。电泳完毕，滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的Ig纯度鉴定。

2. 对流免疫电泳 试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进行电泳。泳动30～90min，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，为阳性反应。

该试验方法主要用于抗原抗体的快速检测。

3. 火箭电泳 将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火箭，故称火箭电泳。

本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲液，接通电源，板端电压4V/cm，电流3mA/cm，电泳2～10h。电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗原定量的测定。

四、补体结合反应

(一)补体的性质

补体是酶类物质，但均以无活性的前体形式存在于血清中;动物血清中尤其以豚鼠血清含量最高，故多用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源;补体性质不稳定，易失活，经56°30min处理即灭活;补体本身没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物相结合，一旦结合后不再游离;补体不与单独的抗原或单独的抗体相结合。

补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。

(二)溶解试验

1.溶血试验 红细胞与相应的抗体(溶血素)相结合后，在补体的参与下，可发生溶血反应(直接溶血反应)，以作补体结合反应的指示系统。

吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。

2. 溶菌试验 某些细菌(如霍乱弧菌)与抗体结合后，如有补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称为溶菌反应或杀菌反应。

本试验的测定可用比浊法。也可用菌落计数法。本法敏感性高，但细菌抗原容易被溶解，且操作时间较长。

(三)补体结合试验

可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质、病毒等，在与相应抗体结合后，其抗原-抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能看到，如再加入溶血系统(绵羊红细胞和相应的溶血素)作为指示剂，以观察是否溶血，来间接判定补体是否被待检抗原-抗体复合物所结合，这就是补体结合试验。参加补体结合反应的抗体称为补体结合性抗体。

本试验包括两个反应系统：一为检验系统(溶菌系统)，即已知的抗原(或抗体)、被检的抗体(或抗原)和补体;另一为指示系统(溶血系统)，包括绵羊红细胞、溶血素和补体。

首先是溶菌系统的抗原与抗体复合物与补体相互混合后产生的反应。其次为了测知溶菌系统中补体是否被利用，再加入溶血系(绵红细胞和抗绵溶血素)作为指示系统，以观察因补体游离所产生的溶血情况。如果反应的结果是不溶血为诊断阳性，发生了溶血为诊断阴性。

敏感性特异性高，但操作较繁，正式试验前要进行下列测定(溶血素效价、补体效价、抗原效价)。

用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、马传染性贫血、鼻疽等的检疫。

五、中和实验

病毒或毒素与相应Ig以一定比例混合后，经过一定时间，病毒丧失对易感动物的致病性，或消除毒素在试管内的溶血现象，谓之中和反应。

该试验可用已知血清鉴定病毒，用于诊断病毒病;也可用已知病毒检测血清抗体，用于诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价(中和价)。

1. 常规中和试验 检查血清内中和抗体的最常用方法，是将不同稀释度的血清与固定量的病毒液(一般为100个TCID50或LD50)混合，置适当的条件下感染一定时间以后，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞和实验动物发生病毒感染的能力及其效价。如果组织培养细胞或实验动物与对照(指仅接种病毒的组织培养细胞或实验动物)一样地出现病变和死亡或形成病毒抗原，那就说明血清中没有中和抗体的存在。这就是固定“病毒-稀释血清法”。第二种测定方法是在固定量的血清中，加入同量不同稀释度的病毒，用对照未免疫血清和待检血清同时进行测定，并以这两份血清中和效价的对数之差的反对数作为待检血清的中和指数。

2.蚀斑减数试验 将病毒-正常血清混合物以及病毒-被检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂，并进行蚀斑计数。比较病毒-正常血清组和病毒-被检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示被检血清的中和能力。

3. 交叉保护试验 先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检病毒的种类或型别。本法的缺点是试验时间太长，并且需要大量的实验动物。

六、免疫标记技术

免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分子或原子，连接在抗体或抗原上，利用抗体(或抗原)能与相应的抗原(或抗体)结合的特性，从而检测抗原或抗体的存在及所在部位(定位)。

免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新技术。这项技术大大开拓了免疫学的应用范畴，使血清学反应进入了一个新的天地。它不仅可以用于抗原抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应用，亦可应用于生物领域其他方面。

(一)免疫荧光法

1. 荧光素 如异硫氰酸荧光素(FITC)、丽丝胺罗丹明B(RB200)等受紫外线照射后可发荧光(FITC为绿色，RB200为玫瑰红色)。

2. 荧光Ig 将荧光素(染料)连接在提纯的Ig分子上，这是用荧光素标记的Ig。免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原所在的部位(定位)。

用荧光抗体检测抗原，敏感，但需荧光显微镜。

(二)酶标记抗体技术(酶免疫测定技术)

免疫酶技术是继免疫荧光技术之后发展起来的又一种免疫标记技术，是根据抗原与抗体特异性结合，以酶做标记物，酶对底物具有高效催化作用的原理而建立的。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的。

免疫酶技术在方法上分为两类：一类用于组织细胞中的抗原或抗体成分检测和定位，称为免疫酶组织化学或免疫酶染色法;另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。

免疫酶染色法是标本制备后，先将内源酶抑制，然后进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与荧光抗体法相同，只是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。

免疫酶测定法分固相免疫酶测定法和均相免疫酶测定法两类。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是固相免疫酶测定法中应用最广、发展最快的一种。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。

酶联免疫吸附试验步骤如下：

第一，使用前将剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。

第二，取出试剂盒中的样品稀释。A1、B1两孔作为阴性对照孔，C1、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。

第三，在稀释板的各孔中加入200μl样品稀释液。在相应各孔中分别加入10μl对照血清或被检血清样品。用加样器重复吹吸数次。稀释每个样品时必须使用不同的吸头。

第四，取出抗原包被板。

第五，分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100μl，加至抗原包被板的相应孔中，加盖后，置37℃±2℃下孵育60min±5min。

第六，洗涤工作液配置：按需要量，用双蒸馏水将洗涤液25倍稀释。

第七，用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300μl，洗涤6次，拍干。

第八，酶结合物工作液配置：用酶结合物稀释液将酶结合物100倍稀释，现配现用。

第九，每孔加入100μl酶结合物工作液，加盖后，置37℃±2℃下孵育30min±2min。

第十，重复步骤七。

第十一，TMB底物工作液配置：将TMB底物B液和将TMB底物A液等量混合，现配现用。

第十二，每孔加入100μl TMB底物工作液，加盖后，置37℃±2℃下孵育15min±1min。

第十三，每孔加入100μl终止液，并轻轻振荡摇匀。

第十四，在15min内，用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值。

第十五，判定：阴性对照孔平均OD值≤0.20，每个阳性对照孔平均OD值≥0.50，且≤2.0。否则，试验无效。计算临界值：临界值=0.23×阳性对照孔平均OD值。被检样品孔OD值<临界值时，判为阴性。被检样品孔OD值>临界值时，判为阳性。

(三)其他免疫标记技术

1. 免疫电镜技术 将免疫学技术与电镜技术结合起来，发展成一种血清学反应超微技术，应用于抗原或抗体的定位，达到亚细胞水平。

2. 生物素-亲和素标记技术 生物素即维生素H，在动物体内广泛存在，以蛋白、肝、肾等组织中的含量为最高。亲和素又称抗生物素，对生物素有较强的亲和力，结合常数高。近年来，利用生物素与亲和素结合，成为一种生物素-亲和素系统。

3. 核酸探针技术 微生物的遗传物质就是DNA。核苷酸是由磷酸、核糖和碱基组成的，而多核苷酸则是由若干个核苷酸连接成的一个大的聚合物。

核酸探针具有检测的灵敏度高，特异性强，是按碱基配对和核酸碱基顺序进行的;使用方便，不需特殊仪器等特点。

核酸探针可用于鉴定病毒、细菌以及某些真核细胞。对那些不易分离培养的病毒可以直接鉴定。

小知识

普通光学显微镜的使用

显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm，10×)、高倍物镜[4mm，(40～45)×]和油镜[1.8mm，(95～100)×]3种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI”字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1 000～2 000倍。在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油。

一、观察前的准备

1. 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。

2. 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。

3. 调节光照：不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜;光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强;检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。

二、低倍镜观察

镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。

将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。

三、高倍镜观察

在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察，并准备用油镜观察。

四、油镜观察

第一，用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。

第二，在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

第三，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。

第四，从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

五、观察完后复原

下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2～3下即可(注意向一个方向擦拭)。

将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。

六、注意事项

镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。

拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

常用染色液的配置

1. 革兰(Gram’s)染液

(1)甲液(结晶紫液)

结晶紫 2g

95%酒精 20ml

1%草酸铵液 80ml

将结晶紫溶解于酒精中，然后与草酸铵溶液混合，静置48h后使用，此液可长久保存。

(2)乙液(革兰碘溶液)

碘 1g

碘化钾 2g

蒸馏水 300ml

将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300ml。

(3)脱色剂 95%酒精溶液

(4)复染液 沙黄液

沙黄(番红) 0.25g

95%酒精 10ml

蒸馏水 90ml

混合过滤即成，贮于褐色瓶中备用。

2. 瑞氏(Wright’ s)染液

瑞氏染料粉末 0.1g

甘油 1ml

中性甲醇 60ml

取瑞氏染料粉末0.1g和甘油1 ml把染料放在研钵内研磨，加少量中性甲醇研磨，使染料溶解，并用完60ml中性甲醇为止。然后把溶解的染料倒入干净的棕色玻璃瓶。配制好的染液在室温中保存，即可使用。新鲜配制的染液偏碱性，放置后呈酸性，染液贮存愈久染色愈好。这染液的适宜pH值是6.4～6.8。

3. 碱性亚甲蓝染液

亚甲蓝 0.3g

95%酒精 30ml

0.01%氢氧化钾 1 00ml

取0.3克亚甲蓝，溶于30毫升95%酒精中，加100ml 0.01%氢氧化钾溶液混合即成，保存在棕色瓶内。久藏的亚甲蓝染色液(6个月以上或更久)可染出细菌的荚膜。

4. 萋-尼抗酸染色液

(1)染色液：石炭酸复红染色液

碱性复红 0.3g

95%酒精 10ml

5%石炭酸水溶液 90ml

混合过滤即成。

(2)脱色剂

浓盐酸 3ml

95%酒精 97ml

(3)碱性亚甲蓝染液(同上)

常用溶液的配制

一、溶液配制注意事项

药品要有较好的质量，试剂分为优级纯(保证试剂，Guaranteedreagent，G.R.)、分析试剂(Analytical reagent，A.R.)、化学纯(Chemi-cal pure，C.P.)和实验试剂(Laboratory reagent，L. R.)等。工业用的化学试剂，杂质较多，只在个别情况下应用，如配洗液用的硫酸、配干燥剂的氯化钙等。

药品称量要精确。

配制试剂用水应用新鲜的去离子水或双蒸馏水，比电阻值在50万Ω以上，pH值在5.5～7.0才可应用，在组织培养等特殊用途时应注意此项要求，配制一般化验用溶液只要求用双蒸馏水或去离子水。

配好后的溶液，应立即除菌处理(如高压灭菌、抽滤或加抑菌物质)，以防杂菌生长。

二、0.067(1/15)mol/L磷酸盐(PB)缓冲液

1.1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液的配制 称取磷酸二氢钾(KH2PO4，A.R.)9.08g，用蒸馏水溶解后，倾入1 000ml容量瓶内，再稀释至刻度(1 000 ml)。

2. 1/15 mol/L磷酸二氢钠溶液的配制 称取无水磷酸氢二钠(Na2HPO4，A.R.)9.47g(或者Na2HPO4·2H2O 11.87g)用蒸馏水溶解后，放入1 000 ml容量瓶内，再加蒸馏水稀释至刻度(1 000ml)。

按下表的比例，配制成不同pH值的缓冲溶液。

磷酸盐缓冲液配制法(单位：ml)