人工授精技术操作规程

猪的人工授精主要包括采精、精液品质鉴定、精液稀释、保存和运输及输精等技术环节。

(一)稀释液配制

1.稀释液的配制要求

(1)与精液渗透压相等。

(2)与精液pH值相同或略低。

(3)具有缓冲酸碱变化的作用。

(4)能补充精子代谢所需的能量物质。

(5)对精子无毒害作用。

(6)长期保存后，仍保持稳定而不变质。

(7)抑菌物质既能抑制细菌生长，又对精子无破坏或抑制作用。

(8)能防止温度陡然下降对精子的有害影响。

(9)在显微镜下检查时，精子清晰可见。

(10)配制简便，价格低廉。

2.稀释液的配制方法　精液稀释液是与新鲜精液渗透压接近，用于扩大精液容量，给精子提供营养，中和精子代谢产物，保持精液pH值的生理溶液。稀释液配制的要求是：

(1)严格按照稀释粉说明书上的配比与蒸馏水混合并保证彻底溶解。

(2)稀释前稀释液温度应与新鲜精液尽可能一致。

(3)稀释液配制后，应维持36～38 ℃1小时左右，以达到渗透压和pH的平衡。

(4)稀释液一旦配制，必须在24小时内用完。

3.稀释液配制用品的准备　接触稀释液任何成分的容器都必须是洁净和无菌的。

(1)三角瓶的清洗：多数稀释液是在三角瓶中配制，每次稀释液倒出后，应立即用蒸馏水冲洗3～4遍，控干水分后，在消毒柜或干燥箱中干燥消毒1小时，自然放凉，直到下次配制稀释液时，再从消毒柜中取出。每周最少一次对三角瓶进行全面认真的清洗消毒：将三角瓶用洗涤剂充分刷洗，用自来水冲净，再用蒸馏水冲洗3～4遍，控干水分。用磁力搅拌器加速溶解的，应同时将磁珠冲洗干净后，放入三角瓶中，用牛皮纸将三角瓶封口，放入消毒柜中干燥消毒1小时。

(2)消毒干燥箱的选择：可选用家用消毒柜或恒温干燥箱。由于三角瓶并不接触精液，而只接触蒸馏水和稀释粉，故消毒要求级别不高，在100～150 ℃温度下干燥1小时就能达到卫生要求。与磁珠一起消毒的三角瓶建议消毒温度为100 ℃，以免磁珠表面塑料融化。

4.稀释液温度的确定　稀释液温度设定的原则是尽可能与采集到的精液温度一致，误差不超过2 ℃。

精液刚刚射出时，温度与其体温一致，但在收集过程中，受环境温度影响，精液温度会有不同程度的下降。最可靠的方法是在一个季节中，实际测量一个正常采集到的精液温度，作为确定稀释液设定温度的依据。但采精时，应使阴茎头到集精杯的距离尽可能地一致，即小指一侧靠近在集精杯的上沿，这样采集到的精液受环境温度的影响可达到最小。稀释液温度的控制，通常采用的方法是将水浴锅温度设定在与精液一致的温度上，然后将配制的稀释液放入水浴锅中维持一段时间。也可按以下建议设定水浴锅温度：夏季为37～38 ℃，冬季为35～36 ℃，温和季节为37 ℃。如果稀释液温度与精液温度存在一定差异，那么，稀释液温度可略低于精液温度，不可相反。

平时要注意检查水浴锅中的水位是否正常(搁板到上沿高度的1/2～2/3)，一个季节设定好水浴锅控制温度后，就不必每天去调整。应注意的是，有些水浴锅的显示温度与稀释液的实际温度误差较大，需要适当调整，以温度恒定后的实际水温为准。准备进行采精的当天，进入实验室后，检查水浴锅水位后，插上水浴锅电源，打开水浴锅电源开关，开始升温，然后进行其他工作。

5.蒸馏水的量取　蒸馏水的量取必须保证以下几条：

(1)使用新鲜的蒸馏水：用于配制稀释液的蒸馏水存放时间不超过30天，最好是新鲜的双蒸馏水。

(2)选用玻璃放水瓶或优质无毒塑料桶盛放蒸馏水：盛放蒸馏水前，必须对容器进行认真清洗和消毒处理;没有干燥消毒设备或不能进行干燥消毒的用品(如纯净水桶)，可洗净后，先用蒸馏水冲洗3次，再用75%的医用酒精冲洗一次，倒扣控干，待酒精完全挥发，再用来盛蒸馏水。以后每3个月用蒸馏水反复洗刷1次。

(3)蒸馏水容器的龙头必须保证不会受到任何污染：最好将龙头用无菌的塑料罩瓶罩住，每次从容器中放出蒸馏水时，应先将最初流出的约10毫升的蒸馏水放入废液杯中后再接取。

(4)用称重的方法量取蒸馏水：蒸馏水的量取，传统方法是用量筒量取。推荐用电子秤称量，其理由是：①避免了蒸馏水在容器间转移可能存在的污染;②量取比较准确。建议选用精度为1克的电子秤，也可选用精度为0.5克或0.1克的电子天平。最大称重量为2 000克或3 000克。

先放出约10毫升蒸馏水，以冲洗放水管，旋下罩瓶，将罩瓶中的蒸馏水倒掉。然后将三角瓶放在电子天平上，按TAR键清零，再放入蒸馏水至1 000克(图4-7)。

图4-7　旋下放水瓶的罩瓶倒掉瓶内的蒸馏水

6.稀释粉的溶解　将三角瓶放在磁力搅拌器上，打开电源开关，缓慢增加转速至形成明显的涡流(图4-8)。然后剪开稀释粉包装，把1 000毫升蒸馏水量的稀释粉缓缓加入三角瓶中(图4-9)。搅拌至稀释粉彻底溶解，继续搅拌1～2分钟，将转速调到最低，关闭磁力搅拌器电源。

图4-8　将三角瓶放在磁力搅拌器上

图4-9　将稀释粉慢慢加入三角瓶中

7.稀释液的升温与平衡　配制好的稀释液须升温到与采集到的精液相近的温度，并逐步达到渗透压和酸碱度的平衡，因此，稀释液必须在水浴锅中保持设定温度45～120分钟，方可用于精液的稀释。操作者应注意观察水浴锅显示的温度，必要时应测定一下稀释液的实际温度，以便与水浴锅的显示温度相对照，如误差较大应进行设定温度的调整。同时将一只2 000毫升的烧杯或塑料杯放入水浴锅中预热(图4-10)。

图4-10　将稀释液放入水浴锅中升温和平衡60分钟，另一塑料杯放入预热

(二)采精操作

1.恒温加热板与集精杯的预热

(1)恒温加热板的预热：精子活力是精液品质的一个重要指标。精液在接近动物体温的情况下才能正常运动，在此温度下才能准确观察到精子的活力。因此，采精前应先对加热板和载玻片预热。打开电源开关，将“设定—测温”开关调到设定(或SET)位置上，调节温度设定旋钮(或按钮)，调定到37 ℃，然后再将开关调到测温位置上。以后使用时，只需要将电源开关打开即可。采精前，将加热板固定在显微镜载物台上，将一张干净的载玻片放在加热板上，打开电源开关。这样，采精后，加热板及其上面放的载玻片能够预热到设定温度，并与载物台达到热平衡(图4-11)。

图4-11　将加热板固定在显微镜载物台上并放上一张干净的载玻片

(2)集精杯的预热：集精杯通常用保温杯代替。集精杯在采精时，温度最好是在37 ℃左右，但要求并不是十分严格，只要达到温暖不烫就可以了。可用电吹风加热至温暖状态(30～37 ℃)。温暖季节不必加温。如有电热恒温箱预热集精杯也可，但设备成本较高，需要预热的时间也较长。

2.集精杯的安装

(1)在集精杯内套一层(或两层)食品袋：将一张食品袋放入集精杯中，将玻璃棒用消毒纸巾擦干净，插入食品袋中(防止外翻时将其拉出)，然后将食品袋外翻在集精杯外沿上，用玻璃棒使袋子贴附于杯内壁。玻璃棒平时可放在一张干净的食品袋中备用。

(2)杯口上固定过滤网：将玻璃棒抽出，打开一次性过滤网的包装袋，拿着过滤网的一角将其取出。将过滤网放在消毒纸巾上对折两次，从第一层处撑开，形成一个锥形，再将过滤网用橡皮筋固定在集精杯上。使过滤网形成一个锥形，放在集精杯上。

(3)将一张消毒纸巾盖在网面上，再将集精杯盖轻轻盖上。

(4)将消毒纸巾盒、PE手套、集精杯放在实验室与采精室之间的传递窗口内，关上传递窗口的门。

3.采精方法与精液收集

(1)锁定阴茎头：脱去右手外层手套。右手呈空拳，当阴茎头从包皮口伸入空拳后，让其在空拳中转动，当感觉到阴茎头已经完全勃起时，用中指、无名指、小指锁定阴茎头，并向左前略向上方牵出，阴茎头一端略向左下方。

(2)不要收集最初射出的精液：最初射出的精液不含精子，而且混有尿道中残留的尿液，细菌含量高，对精子有毒害作用。当公猪射出部分清亮液体(约5毫升)后，用纸巾擦干净右手及公猪阴茎头上的胶状物、液体。

(3)防止精液被包皮液污染：包皮液混入精液会造成精子凝集而被废弃。为了防止未挤净的包皮液顺着阴茎流入集精杯中，采精时，要保证阴茎阴茎头端的最高点略高于包皮口，但要注意，如果过度抬高，可能会损伤公猪的阴茎;如果无法将阴茎头抬高，应注意观察是否有包皮液顺阴茎流出，如有，应将集精杯放下，左手拿纸巾将其吸附。但关键还是要在采精前将包皮液挤净。

(4)收集含有精子的精液：当公猪射出乳白色或奶油色的精液时，左手将集精杯口向上接近右手小指正下方。公猪射精是分段的，清亮的精液中基本不含精子，应将集精杯移离右手下方，当射出的精液有些乳白色混浊时，说明是含精的精液，应收集。最后的精液很稀基本不含精子，也不要收集。但应注意，当精液开始变清时，不要马上停止收集，稍等片刻再停止收集，因为看似清亮的精液还含有一定浓度的精子。

(5)要保证公猪的射精过程完整：采精过程中，虽然最后射出的精液不收集，但也不要中止采精，直到公猪阴茎软缩，环顾周围，试图爬下假母猪，再稍微松开公猪的阴茎头，让其自然软缩退回。经常不完整的射精会导致公猪生殖疾病而过早被淘汰。

4.采精后的工作

(1)确保公猪安全跳下假母猪：采精完毕后，应看着公猪安全地跳下假母猪。有些公猪在跳下后，一条前肢会搭在假母猪上无法取下来，应给予帮助。

(2)取下过滤网：将右手小指压住过滤网的一侧，食指和拇指从另一侧将过滤网及上面的胶状物翻向手心。要注意防止橡皮筋脱出后，胶状物掉入集精杯中。

(3)将精液放入传递口：将精液袋束口放于杯沿上，盖上杯盖。将集精杯放入采精室与实验室之间的传递窗口内，关上传递窗口的门。

(4)将公猪赶回公猪舍：如果采精员要同时做实验室精液的处理工作，那么，必须先将公猪赶回猪舍后，再进行后面的工作。不少采精员喜欢在公猪采精后，给公猪喂两个生鸡蛋，既是对公猪成功采精的犒赏，又能给公猪补充动物蛋白，有利于生精功能恢复。

5.采精频率

采精频率是指一头公猪一定时间内采精的次数，常用每周采精次数表示。适宜的采精频率是与公猪生精能力和每次射精的总精子数相适应的，不同个体的最适宜采精频率可能各不相同。有关公猪使用及采精的相关参数可参照表4-3。

表4-3　有关公猪的使用及采精的相关参数