第一节 牛羊寄生虫流行区系的调查研究

一、研究内容

牛寄生虫流行区系调查研究和羊寄生虫流行区系调查研究，具体内容包括寄生虫感染种类、感染率、感染强度、地理分布等，在统计感染率和感染强度的基础上确定优势虫种。

感染强度：感染某种寄生虫数量的多少，用最少数量与最多数量区间表示。

平均感染强度：感染某种寄生虫的平均数量。

优势虫种：感染率最高和感染强度最大的寄生虫，有时也可以直接把感染率最高的寄生虫确定为优势虫种。

二、研究方法

(一)调查区域的划分

根据辽宁省的地理、气候及畜禽分布特点将全省划分为辽南(大连、营口、鞍山)、辽北(铁岭)、辽西(锦州、阜新、朝阳、盘锦、葫芦岛)、辽东(丹东、本溪、抚顺)、辽中(沈阳、辽阳)5个区域。

(二)调查样本的确定

每个区域内，随机抽检30头牛、30只羊，共计抽检牛150头、羊150只。

(三)寄生虫检查方法

采用全身性寄生虫学剖检法和现场临诊检查相结合的方法，对抽检的牛羊逐一编号，辽西地区抽检的牛羊主要与辽宁医学院畜牧兽医学院教学实习动物综合利用，其他地区抽检的牛羊则跟踪到屠宰场检查。

1.对体内蠕虫的检查

采用全身性蠕虫学剖检法，具体方法：

(1)剥皮后检查

注意皮下结缔组织的病变特性，脂肪沉积和色泽等注意浅表淋巴结和乳腺等的状况。

(2)剖开体腔检查

首先切去四肢，再剖开胸腔和腹腔，注意观察体腔中脏器的位置关系，浆膜面的色泽等，观察胸腹水的多少。

(3)取出各内脏器官

①消化器官的取出

首先在咽部后方切断食管，并将其与气管分离后结扎。切断直肠并结扎，切断肠系膜根部以及各部相连的韧带。将消化管及其附属腺、脾脏等一起取出。

②呼吸及血液循环器官的取出

先在喉部后方切断气管，进而剥离和切断胸腔纵隔与心包胸壁间的有关韧带，并切断前后主动脉和腔静脉，将呼吸器官和心脏、血管一起取出。

③泌尿生殖器官的取出

首先揭开腰背部腹膜壁层剥离出肾脏，切断肾动、静脉，剥离输尿管，切断和剥离膀胱、生殖器官和盆、腹腔四壁相连的有关韧带和结缔组织，最后将泌尿和生殖器官一起取出。

(4)对剖检内容物的处理和虫体的收集方法

①沉淀法

先将器官内容物倒入桶内并加入1%～2%食盐水后用玻璃棒或光滑的木棒充分搅拌，然后静置10～15min，待器官内容物和虫体沉淀后，缓慢倒出上清液，然后再加水搅拌后，重新静置。如此反复多次直到上层液完全透明为止，将沉淀物分若干次倒入平皿内，在黑色的背景下仔细检查，发现虫体后，用毛笔小心将虫体挑出，将形态相近的虫体放在同一烧杯中待检。装虫体的烧杯中要加生理盐水。

②筛箩过滤法

上述沉淀法需要很长时间，有时为了节省时间，往往对内容物采取筛箩过滤法。

将内容物倒入桶或大盆内，加入1%～2%食盐水充分搅拌后，直接用80～120目的筛箩在缓慢的流水下过滤，将内容物中的可溶性物质及色素全部洗净为止。然后将筛箩倒转，把其中的沉渣仔细地冲洗到另一个容器中，加入一定量的生理盐水或加1～2%的食盐水。要注意把筛箩底部的虫体都冲洗干净，从沉渣中检出虫体。

③压片法

将脑、脊髓等实质器官切成小薄片，夹在两张载玻片之间检查。

④黏膜刮取法

用金属、木制的小片，一般都采用一张载玻片刮取黏膜的表面，对刮取物可用沉淀法或压片法处理后镜检。

⑤黏膜拨检法

此法多用于检视胃或大肠，用弯头眼科小镊子对黏膜和紧贴黏膜层的内容物慢慢仔细地进行拨检，一边拨出，一边观察，并挑出所发现的虫体。

(5)各器官的具体检查和处理方法

①肠系膜和淋巴结的检查

对肠系膜、大网膜表面，注意有无细颈囊尾蚴的寄生。

②消化管的检查

先在小肠起始部、空肠与回肠交界处结扎并切断。然后将各段肠管分别放入各自的容器中，分别加以处理。

对食管：按食管纵行切开，仔细观察黏膜内有无筒线虫，纹皮蝇幼虫的寄生。在食道的浆膜面应检查有无肉孢子的寄生。

对第一胃：首先将其胃壁剪开，但不要搅动其内容物，只需检查内容物表层和黏膜面就可以。对黏膜表层内容物可用拨检法检查，注意有无前后盘吸虫的寄生。

对第二、三胃：也用拨检法检查，有时可有前后盘吸虫寄生。

对第四胃：首先将胃壁剪开，将内容物倒入桶或大盆内，用沉淀法进行处理，并将胃黏膜在1%食盐水中进行刷洗，然后对刷洗液也用沉淀法进行处理。最后将沉淀物用平皿分若干次在黑色背景下检查并收集虫体。将洗净的胃壁平铺在磁盘内，刮取黏膜表层，对刮取物也用沉淀法处理后检查。

在此项检查中，应注意下列寄生虫的寄生：血矛线虫，奥斯特线虫，蛇形毛圆线虫等。

对小肠：分离以后放在大盘内，由一端注入1%的生理盐水500～1000ml，将肠内容物冲洗至桶内，如此冲洗两次。取出大型虫体(绦虫等)，然后对内容物用沉淀法处理后，检查沉淀物。肠壁用玻璃棒翻转，刮取肠黏膜表层，压片镜检。

对盲肠、结肠和直肠：从肠系膜附着部沿纵向剪开肠管，一般常用拨检法，对内容物和黏膜表面进行检查。也可以对其内容物按沉淀法处理后检查。对其黏膜刮下物压片镜检。

③消化腺

肝脏和胆囊：首先分离并剪开胆囊，将胆汁倒入烧杯中，对胆汁和胆囊黏膜刮取物分别用沉淀法处理后检查虫体。

肝脏，用手将其撕成小碎块，放入容器中并用1%食盐水冲洗，用手挤压肝组织块使虫体排出。然后取出肝组织块，对冲洗液用沉淀法处理后，检查并收集虫体。

在撕碎肝脏前，如发现肝脏表面有小坏死灶，应剪下压片镜检。

胰腺：检查方法同肝。

④气管、支气管和肺脏

首先观察肺脏的形态、色泽、硬度及有无肿胀。然后沿纵向剪开气管、支气管和细支气管，发现虫体后用毛笔挑出。对气管黏膜刮下物应压片镜检。

其次对肺组织用手钝性撕碎按肝脏的方法检查。

⑤心脏、血管、脾

心脏、心包和血管：

注意心包膜及其内容物，切开后，观察心内膜、心肌、心腔等，对其内容物洗在容器中，沉淀后检查。对心肌可进行切片检查，观察有无囊虫的寄生。

脾脏：注意观察其大小、硬度、色泽、包膜、脾髓及脾小梁、淋巴结等。

⑥泌尿生殖器官

肾脏和肾上腺：观察外形、色泽和质度。切开后眼观检查有无虫体，必要时可进行压片镜检。输尿管、膀胱：纵向切开输尿管和膀胱，收集内容物，并进行黏膜刮取，将内容物和黏膜刮取物按沉淀法处理，收集虫体。

生殖器官：检查其内腔、刮取黏膜压片检查，必要时，也可用刮取物涂片染色镜检。

⑦肌肉

切开咬肌、腰肌、肋间肌、舌肌以及肩围臀部或腰、背的伸肌和屈肌，观察这些地方有无虫体寄生。

⑧眼睛

首先观察结膜及角膜，然后刮取或冲洗结膜，对冲洗液进行沉淀法处理检查。剖开眼球，收集眼房液，用沉淀法处理后检查。

⑨脑

打开颅腔，观察脑膜及脑髓有无脑多头蚴的寄生。

通过上述检查，收集全部虫体，对肉眼容易鉴定的虫体立即鉴定并做好记录，对肉眼不易鉴定的虫体采用下列方法处理和鉴定，吸虫、绦虫用70%保存，盐酸卡红染色，二甲苯透明后制片鉴定;线虫用70%酒精保存，甘油透明后逐条鉴定;在统计感染率和感染强度的基础上，确定优势虫种。

2.对牛羊螨病的检查

通过现场临诊观察，发现临床症状和病变后，直接刮取病料，采用皮屑消化法(沉淀法)进行检查，鉴定螨虫的种类，并统计感染率。

(1)病料的采集：病料采集的正确与否是螨病诊断的关键。其采集部位在动物健康皮肤和病变皮肤的交界处，先剪去该部的被毛，用经过火焰消毒过的外科刀，使刀印和皮肤垂直，用刀刮取病料，一直刮到微微出血为止，刀刮的病料放入消毒过的小瓶或带塞的试管中。刮取病料处用碘酒消毒，以防感染。

(2)皮屑消化法(沉淀法)操作技术：将病料侵入盛有5%～10%的氢氧化钠溶液的试管中，经1～2h皮屑软化溶解，弃去上层液后，用吸管吸取沉淀物，滴于载玻片上加盖片镜检。为加速皮屑的溶解，可以将病料侵入10%的氢氧化钠溶液的试管中，在酒精灯上加热煮沸数分钟，待其自然沉淀或以每分钟2000转的速度离心沉淀5min，虫体即沉于管底，弃去上层液，吸取沉淀物制片镜检。

3.对牛羊虱和寄生硬蜱的检查

首先观察家畜体内侧薄皮部位——股内侧。肘内侧、下腹壁、肉垂、耳壳内部有无蜱的存在，如果发现有，应将其取下装入标本瓶中加盖和投以标签。如果虫体附于皮毛上不易取下时，可滴加少量的稀酒精即可取下。

观察体表有无虱的存在，发现后同样装入标本瓶中，加盖和投以标签。

把封存好的标本瓶带到实验室。在电解剖显微镜和普通显微镜下鉴定其种类。根据感染率情况确定其优势虫种。

4.对羊鼻蝇蛆的检查

由鼻孔后方，向后沿水平线锯开，再由两眼内角连接线向下垂直锯开后，检查有无鼻蝇幼虫的寄生，直接取出虫体，在实验室电解剖显微镜和普通显微镜下鉴定其种类。

5.对牛皮蝇蛆的检查

检查牛背部两侧皮肤，观察有无皮蝇蛆三期幼虫寄生，直接取出虫体，在实验室电解剖显微镜和普通显微镜下鉴定其种类。

6.对羊体寄生蚤的检查

采集羊体寄生蚤，分别放入75%的酒精瓶内固定，带回实验室后，首先在立体显微镜下进行大致观察，将形态相同的虫体归为一类，然后随机从不同种类的虫体中抽检雌、雄虫各5只，按昆虫标本制作方法，进行销蚀、中和碱性、脱水、封片。干燥后在生物显微镜下进行观察、描述。

7.对牛羊球虫的检查

粪样的采集与检查：从每个调查点随机采集牛羊的新鲜粪便，分别置于干净的小塑料袋中，编号并记下牛羊的日龄、粪便外观等。将粪样带回实验室，保存于4℃冰箱中待检。从每个粪样中称取2g，分别置于干净的小烧杯中，向其中加入20 ml饱和盐水，搅拌均匀后，经60目铜丝筛过滤，再将滤液倒入三角烧瓶中，使液面略高出瓶口，盖上盖玻片，静置40分钟后，将盖玻片以湿面覆于载玻片上，镜检。

卵囊的分离与培养：将阳性粪样分别置于干净的小烧杯中，再加入适量的2.5%重铬酸钾溶液，盖上平皿，置于25℃的恒温箱培养7天后，取培养物分别经60目铜丝筛和260目尼龙筛过滤，倒去粪渣，将滤液置于离心管内，以2000 r/min的速度离心10分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入饱和盐水搅拌均匀，再置于离心机内离心(转速和时间同上)，取出，用直径为0.8cm的铁丝圈蘸取表层液膜，置于载玻片上，盖上盖玻片，镜检。再吸取上层液体，反复水洗沉淀，收集卵囊。

球虫种类鉴定：观察卵囊和孢子化卵囊的形状、颜色，测量卵囊的大小。根据卵囊和孢子化卵囊的形态、大小，参照图谱和有关文献资料进行虫种鉴定。并统计其感染率。

饱和盐水配制：把食盐加入沸水锅内，直到食盐不再溶解而出现沉淀为止(1000ml沸水中加入约400g食盐)。精制盐配制的饱和盐水一般不必过滤，待冷却后即可使用(冷却后的溶液有食盐结晶析出，即为饱和);粗制盐配制的饱和液可用滤纸、纱布或棉花过滤后备用。

8.对牛羊焦虫的检查

宰前抽取耳静脉血，涂片染色后在油镜下检查，确定焦虫种类，并统计其感染率。

(1)直接涂片染色检查法

血片的涂制：涂片用的载片必须彻底洗净，表面无油脂、酸、碱等痕迹，也无灰尘和污物。玻片表面平滑，无刻纹，边缘磨平。通常把彻底洗净的玻片浸于酒精或乙醚中，临用前取出晾干。涂片采用耳静脉血，耳尖剪毛，用70%酒精消毒，待皮肤干燥后用消毒过的针头刺出第一滴血液。滴在载玻片一端距端约1cm的中央。然后迅速取第二张载玻片，与第一张载玻片成45°角，平稳地向另一端推进，使血液在载玻片上成均匀的一薄层，再将其放平晾干。每一个动物必须制作三张血片供检。

血片的染色：常用的染色法有两种：瑞氏染色法和姬氏染色法。

瑞氏染色法：滴加瑞氏液1～2滴于晾干的血片上，1min后加等量的缓冲液或中性蒸馏水与染液混合，经5min后用缓冲液或中性蒸馏水冲洗，干燥后在油镜下镜检。

瑞氏染色原液的配制：

瑞氏染色粉：0.3g

中性甘油(化学纯)：3ml

无水甲醇(不含丙酮)：97ml

把染色粉与甘油一起在乳钵中研磨混合，而后加入甲醇，彻底搅拌，把混合物装在暗色瓶中，封严，经2～3周，过滤后即成原液，该染液放置时间越长，染色效果越好。

缓冲液的配制：

第一液：磷酸氢二钠11.87 g

中性蒸馏水1000 ml

第二液：磷酸二氢钾9.077 g

中性蒸馏水1000 ml

取第一液61.1 ml和第二液38.9ml混合后，即成pH为7.0的缓冲液。

在没有缓冲液时，也可用中性蒸馏水代替，但必须是封闭保存的蒸馏水。以防止吸收空气中的二氧化碳而变酸。

姬氏染色法：待血片干燥后，滴2～3滴无水甲醇于血膜上使其固定2～3min，而后置于稀释的姬氏染色液(将原液充分振荡后，用缓冲液或中性蒸馏水稀释10～20倍)中染色30～60min。最后用缓冲液或中性蒸馏水冲洗后晾干，在油镜下检查。

姬氏染色原液的配置：

姬氏染色粉：1.0 g

中性甘油(化学纯)：66 ml

无水甲醇：66 ml

把染色粉与甘油一起在乳钵中磨碎，混匀后在55～60℃水浴锅上加热，使粉末溶解在甘油内，冷却后加甲醇，放置2～3周，过滤备用。此液必须保存在有色的玻璃瓶内，加盖封严。

(2)集虫检查法

上述方法虽然可以查到血液中的原虫，但血液中的虫体较少时，则不易查出虫体，为此，经常采取先对虫体进行集虫，再进行制片检查的方法。具体操作是：

采静脉血液按1∶1的比例与2%的枸橼酸钠液混合，然后以每分钟500～700转的速度离心5 min后，用吸管吸取上层血浆移入另一离心管中，并加些生理盐水，再以每分钟1500～2000转的速度离心10min，除去上层液，吸取沉淀物涂片，按姬氏或瑞氏染色法染色检查。

(3)泰勒焦虫病淋巴结穿刺物的检查法

在肩前淋巴结或股前淋巴结进行穿刺，穿刺前，先对皮肤进行剪毛，酒精消毒后，用手将淋巴结推进皮肤表层，用一手固定住淋巴结，再用另一手将灭菌的针头刺入，接上10 ml的注射器后吸取穿刺物。将穿刺物涂于载片上，干燥，甲醇固定后用姬氏染色法或直接用瑞氏染色后，镜检发现石榴体后确诊。

三、研究结果

(一)辽宁省牛寄生虫流行区系研究结果

(1)此次调查共发现辽宁省牛体内外寄生虫46种，分别隶属于7纲25科39属，虫体名称、感染情况及地理分布情况等详见表3。

表3 辽宁省牛寄生虫流行区系调查研究结果