第七节 病原微生物检查及诊断

一、显微镜检查

1.细菌涂片标本制作

取洁净无油的盖玻片，先在火焰上略加烧灼，凉后根据要求取材料涂片，自然干燥。依椐不同染色液进行染色、水洗，干燥后用高倍显微镜检查。

2.常用细菌染色法

(1)碱性美蓝染色法：用于细菌形态检查，对有两极着色的细菌效果明显。久陈染液荚膜为红色，菌体为蓝色。

染色液：甲液为美蓝0.3克+95%酒精30毫升，乙液为0.01%氢氧化钾溶液100毫升，甲液+乙液混合而成。

染色方法：火焰固定涂片，滴加染液，染1～2分钟，水洗至无色，用吸水纸吸干，镜检。

(2)革兰染色法：用于细菌鉴别，分为革兰阳性细菌(细菌染为紫色)和革兰阴性细菌(细菌染为红色)。

染色液：结晶紫溶液，甲液为结晶紫2克+95%乙醇20毫升，乙液为草酸铵0.8克，加蒸馏水80毫升混合而成;革兰碘液，碘1克+碘化钾2克(先加3～5毫升蒸馏水将碘化钾溶解，加入碘，充分溶解)，加足蒸馏水至300毫升;95%乙醇;复染剂，如沙黄复染剂(2.5%番红纯酒精液10毫升+蒸馏水90毫升)或碱性一品红复染剂(碱性一品红复染液0.1克+蒸馏水100毫升)。

染色法：火焰固定涂片，滴结晶紫溶液染1～2分钟;水洗，加革兰碘液，固定1～2分钟;水洗，用95%乙醇脱色30秒;复染，用沙黄复染剂或碱性一品红复染剂染0.5～1分钟;水洗，吸干，镜检。

(3)瑞特染色法：用于白细胞分类，巴氏杆菌两极着色，炭疽荚膜显示特殊结构。

染色液：瑞特染粉0.1克+纯甘油1毫升+中性甲醇60毫升。

染色法：涂片自然干燥;滴加染液1毫升，染1分钟;加等量蒸馏水，摇动混匀，约5分钟;水洗，吸干，镜检。

(4)姬姆萨染色法：用于血液寄生虫的检查，白细胞分类，细菌形态检查，巴氏杆菌两极着色，炭疽荚膜显示特殊结构。

染色液：姬姆萨氏粉0.6克+甘油50毫升，55～60℃作用0.5～2小时，再加甲醇50毫升，混匀，静置1天以上，过滤备用。

染色法：稀释染色液，滴10滴染色液于10毫升蒸馏水中;涂片自然干燥，放入甲醇液中3～5分钟或滴加甲醇;待盖玻片干后，放入有稀释染色液的染色缸中半小时至数小时;水洗，吸干，镜检。

二、细菌分离培养

目的在于从被检病料中进行细菌分离并获得纯培养，为确诊细菌传染病提供依据。

1.常用商品化培养基

普通营养肉汤培养基，供一般细菌生长需要，检查细菌生长表现，如混浊度、沉淀、菌膜。普通营养琼脂培养基，为分离细菌进行纯培养，或做药敏试验。鲜血琼脂培养基，用于嗜血性和要求严格的细菌。麦康凯琼脂培养基，常用于大肠杆菌类细菌分离培养鉴定。SS培养基，常用于沙门菌属细菌培养与鉴定。沙堡弱琼脂培养基或马铃薯琼脂培养基，用于真菌培养。

2.细菌分离培养

分离培养方法可依据需要选用。

(1)划线法：

平板划线法：将病料直接或经适当稀释后接种于培养基上，用于药敏试验和细菌分离。

试管斜面划线法：将病料直接或经适当稀释后接种于培养基上，用于菌种保存。

(2)加热分离法：用于污染材料中的芽胞杆菌及梭菌的分离。方法是将病料接种于液体培养基中，置于80℃水浴中加热15～20分钟，以杀死非芽胞菌，而后取此培养物以划线法接种于培养基上，进行需氧或厌氧培养。

(3)厌氧培养法：将需氧菌或厌氧菌共同培养在平板上，各划线一半，用石蜡密封，37℃温箱中培养2～3天后观察。

(4)动物分离法：将病料接种于易感动物，待动物死后，从死亡动物心血及病变组织分离适用于严重污染的材料。

(5)细菌纯培养：取细菌培养的单个菌落，接种于普通平板培养基或选择培养基上，37℃单独进行培养，可获得纯细菌。

三、生化特性试验

细菌具有各自的酶系统，在相应的培养基上，在新陈代谢过程中可产生不同的分解及合成代谢产物，并具不同的生化特性，从而可以进行细菌鉴定。为提高准确性，应用纯培养可防止污染。常用的生化特性试验有以下几种，相关培养基均有商品化产品出售，按说明书使用。

1.糖发酵(醇、苷)试验

细菌含有发酵不同糖类的酶，可分解各种糖、醇和苷，产酸、产气或不分解。常用的有乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、山梨糖、甘露醇、水杨苷。

方法：将被检菌培养物分别接种于选择性糖发酵培养基中，置37℃温箱中1～2天，观察有无产酸、产气。

2.靛基质试验

细菌分解蛋白质中的色氨酸产生靛基质，加吲哚试剂形成玫瑰色。

方法：细菌接种蛋白胨水培养基中，置37℃温箱中培养2～3天，沿试管壁滴加吲哚试剂0.5毫升于培养液表面，轻摇，红色为阳性，黄色为阴性。

3. VP试验

葡萄糖→分解丙酮酸→产生乙酰甲基甲醇+O2→二乙酸+精氨酸的胍基→红色化合物。

方法：细菌→含1%葡萄糖的蛋白胨水(pH值7.6)→置37℃温箱中培养2～3天，VP试剂，充分摇动试管→红色为阳性。

4.美蓝还原试验

细菌使美蓝还原为无色(阳性)或蓝色(阴性)。

方法：细菌接种美蓝牛乳培养基中，置37℃温箱中培养4～6小时，红色为阳性。

5.硫化氢试验

细菌分解硫氨基酸，产生硫化氢，加重金属盐(铝铁)形成硫化铝(铁)黑色沉淀物。

方法：细菌穿刺接种于醋酸铅琼脂培养基中，置37℃温箱中培养24小时，沿穿刺线变黑色为阳性，无色为阴性。

6.尿素分解试验

变形杆菌等肠道杆菌的尿素酶，分解尿素形成氨，使培养基变碱性，遇酚红指示剂呈红色。

方法：细菌接种于尿素培养基斜面，置37℃温箱中培养4～6小时或24小时，红色为阳性，无色或黄色为阴性。

7.接触酶试验

细菌接触酶→催化H2O2溶液放出初生态氧(O2)→出现气泡，大部分厌氧菌不产生接触酶。

方法：取18～24小时单个菌落→涂片→加3%H2O2溶液一滴→半分钟内产生气泡为阳性，无气泡为阴性。

8.明胶液化试验

有胶原酶的细菌能使明胶失去凝固力，呈现液化状态为阳性，不液化为阴性。

方法：细菌穿刺接种于明胶培养基，置22～25℃温箱中培养5～7天，每日观察，如发生融化，液化部分呈流体状态(将试管倾斜可看到)，则为阳性。

9.溶血试验

细菌溶血素使动物红细胞溶解。

方法：细菌接种于血液琼脂平板，置37℃温箱中培养24～48小时，菌落周边出现透明溶血环为完全溶血，出现绿色溶血环为不完全溶血，无变化为不溶血。

10.枸橼酸盐利用试验

细菌如能分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基呈碱性，指示剂呈碱性反应，由绿色变成蓝色。

方法：细菌接种于枸橼酸盐培养基上，置37℃温箱中培养2～4天，由绿色变成蓝色为阳性，不变色为阴性。

11.凝固酶试验

致病性葡萄球菌能产生凝固酶，直接作用于血浆的纤维蛋白原，出现凝集现象。

方法：在清洁的盖玻片上，分别各滴一滴血浆(兔或人)和盐水，然后挑取菌落分别与血浆和盐水混合，在室温下观察。如血液中有明显颗粒或凝块，而盐水中无凝集现象，则为阳性。

四、药物敏感试验

指细菌对抗菌药物的敏感性试验，各种细菌对抗菌药敏感性不同，即使同种细菌的不同菌株，对同一种药物的敏感性也有差异。因此，使用药物前先进行药物敏感试验，选出其中的高敏药物，应用于临床治疗很有必要。

1. 纸片法

采用市售或自制药敏纸片进行。先将细菌均匀涂布在普通琼脂平板，然后用无尖镊子取各种药敏纸片贴于培养基上，中央一种，周边几种，纸片间隔开，置37℃温箱中培养24小时后观察。极敏抑菌圈直径>20毫米，高敏抑菌圈直径15～20毫米，低敏抑菌圈直径<10毫米，不敏感无抑菌圈。

2.挖孔法

按药品含量和用药量计算出药物浓度，由高到低配成所需浓度，原粉不低于0.2克，复方药不少于2克。用上下相通的金属打孔器(直径3毫米)挖孔，上端安装胶皮吸头，便于吸取多余琼脂或用针挑出多余琼脂，用酒精灯火来回3次封底。然后用移液器吸取药物0.025毫升，加满孔内，不要溢出孔外，置37℃温箱中培养24小时后观察，判断标准同纸片法。

五、动物试验

选用健康无病的动物(兔、鼠、鸡)进行病料接种、隔离饲养，观察临床表现。采血进行实验室检验，对死亡动物进行解剖，观察病理变化，进行综合分析，为诊断提供依据，试验应设对照。

六、血清学试验

病原微生物进入机体，可刺激机体产生相应抗体，这种抗体与相应抗原相遇可产生特异性反应，因此，可利用已知抗原鉴定病畜禽血液中相应的抗体，或用特异性诊断血清(已知抗体)来鉴定病原体(抗原)。常用其诊断细菌性病、病毒性病、寄生虫病。

1.凝集试验

颗粒状态抗原(凝集原)与相应抗体(凝集素)结合后，在有电解质存在时抗原抗体相互凝集成丛，利用此现象广泛用于病原的血清学鉴定。

(1)平板凝集试验：简便、迅速，适用于大群现场操作，做病原定性，常用于鸡白痢、鸡支原体病的检疫。取洁净玻板一块，划成4厘米2的小格若干。用吸管吸取一滴0.025毫升诊断抗原，滴于小方格中央，取等量被检全血或血清滴于抗原上，混匀，2～3分钟观察。无凝集现象，保持原来均匀混浊状态为阴性(-);50%凝集，液体稍透明，有可见凝集块为弱阳性(+);75%凝集，1～2分钟后，液体几乎完全透明，有明显凝集块为阳性(++);100%凝集，数秒钟液体完全透明，有大凝集块为强阳性(+++)。

(2)试管凝集试验(常量法)：取小试管6支立于试管架上，1支稀释待检血清，1支对照，4支做测定(按表4操作)。

表4 试管凝集试验