第七节 寄生虫病常用实验室诊断技术

一、寄生虫粪便样品的采集

粪便检查必须采用新鲜粪便，在必要时，对大家畜可进行直肠内直接采粪，对一般家畜可进行清水灌肠采样。采集的粪样须装入洁净的大口瓶，也可置于洁净的油纸或塑料袋内，于数小时内进行检查。

对草食兽的采粪量必须多于肉食兽。采样时必须同时采集粪便的内、外各层才有代表性。

如果粪样不能当时进行检查，则应放在普通冰箱内或阴冷处，以抑制虫卵或幼虫的发育和防止粪便的发酵。如需转送他处检查的，则可将粪样浸入5%～10%的福尔马林中，将病原体固定，使其丧失生活力。

二、寄生虫肉眼检查法

先用肉眼检查病畜排出的粪便，而且以早晨排出的粪便最适宜。寄生于猪、羊消化道下部——大肠的结节线虫常随粪便排到体外。此外，随粪便自然排到体外的，尚有蛔虫类(猪蛔虫、犬弓蛔虫、猫弓蛔虫、鸡蛔虫、马副蛔虫)、马蛲虫等。

动物粪便往往提示该动物有无寄生虫病。假若粪便夹杂有黏液和血液时，小狗常可被怀疑为钩虫病，牛和成年狗等则可被怀疑为日本血吸虫病;如果绵羊的粪便附着黏液时，常被怀疑有肠结节虫病;若将这种粪便(特别是含血液和黏液的部分)做成涂片镜检时，常可检出日本血吸虫卵、钩虫卵、肠结节虫卵、绦虫卵及其他肠道原虫、肠寄生螨等。

有时粪便的性状也可作为推测某些寄生虫病的参考，如区别固形粪便、半固形粪便、软便、下痢、稀便等。如4～5月龄羊羔下痢的粪便为暗绿色，一般称为黑痢病，常常是毛圆线虫寄生所致。小猪下痢的粪便为白色时，则往往是由粪类圆线虫引起的。

如果为测定各种驱虫药物的疗效，则必须在驱虫后2～4d内，每天收集动物全部粪便以检查排出的寄生虫虫体。但对大家畜(马、牛等)可考虑用下述的检查法：将一昼夜的粪便全部收集，充分混匀，平分为10份，随机检查其中1份，鉴定所找出的蠕虫种类，统计每种蠕虫的数目，并以此数乘以10，即得出一昼夜粪便中该种蠕虫的估计量。

粪便检查是寄生虫学检验的重要手段，因为所有消化道以及某些其他部位的寄生虫的卵或幼虫，都可经过肛门排到体外。但上述寄生虫若还处于未成熟阶段或为单性寄生时，则不可能找到虫卵，或仅能发现未受精的虫卵。

三、寄生虫虫卵、幼虫、卵囊、包囊的检查

粪便内虫卵、幼虫或卵囊、包囊的检查，有直接涂片法和浓集法两种，后者又包括沉淀法、漂浮法和沉淀漂浮法3种。

1. 直接涂片检查法 取50%甘油水溶液或普通水1～2滴滴于载玻片上，镊取黄豆大小的被检粪块与之混匀，剔除粗粪渣，抹薄涂匀，盖上盖玻片镜检。这是最简单和常用的方法，但检查时因被检查的粪便数量小，检出率也较低。也就是说，当体内寄生虫数量不多而粪便中虫卵少时，有时不能查出虫卵。为提高阳性检出率，每个样本应检多片。本法对于产卵较多的蠕虫(如蛔虫、捻转胃虫、毛圆线虫等)和球虫卵囊的检出率甚高。但不适用于含有粗大夹杂物的草食兽粪便的检查。

2. 漂浮集卵法 应用相对密度较虫卵大的漂浮液，使蠕虫卵、球虫卵囊等浮于液体表面，易于集中检查。漂浮集卵法对某些线虫卵、绦虫卵和原虫卵囊有很好的检出效果。缺点是高比重的漂浮液易使虫卵和卵囊变形，检查时必须迅速，也可在制片时补加一滴清水。

常用方法为饱和盐水漂浮法。取5～1og粪便置于200ml烧杯中，先加入少量饱和盐水(1L水中加食盐400g)，搅拌混合后再加入约20倍的漂浮液，用金属筛或纱布滤去粪渣，滤液静置30～60min，用直径0.5～1.0cm的金属圈蘸取表面液膜，抖落于载玻片上，加盖片后镜检。

常用的饱和液还有硫代硫酸钠饱和液、硫酸镁饱和液、硝酸钠饱和液、硝酸铵液、硝酸铅液等。检查密度较大的虫卵，如棘头虫虫卵、猪肺丝虫虫卵及吸虫卵时，需用硫酸镁、硫代硫酸钠以及硫酸锌等饱和溶液。

3. 沉淀集卵法 用水处理粪便，经离心或自然沉淀，使虫卵沉淀集中，更易于检查。

自然沉淀集卵法是取粪便5～10g加水混合成悬浮液，经40～60目铜筛滤去大块物质，静置15min后倾去上清液，如此反复操作，直至上层液体透明为止，最后弃去上层液体，置沉淀物于载玻片上，镜检虫卵。

离心沉淀法是取1～2g被检粪便于试管中，加5倍量的水制成悬浮液，经40目铜筛过滤到一离心管中，以800r离心3～5min，弃上清，将沉渣置载玻片上，镜检虫卵。

本法也适用于检查尿液内的虫卵。

4. 麦氏计数法 是常用的虫卵计数方法之一。通过虫卵计数，可以估计动物感染强度。

取粪样2g放入三角烧瓶内，加饱和盐水58ml和玻璃珠若干，充分振荡使成混悬液，吸取混悬液注入麦氏计数室，置显微镜下计数计数室(1cm2)内虫卵数。由于每室混悬液等于0.15ml，结果乘以200，即为每克粪便虫卵数。通常一次计数4室，然后按平均值计。本法只适用于可被饱和盐水漂起的各种虫卵。

麦氏计数室由二片载玻片制成。为了使用方便，其中一片较另一片窄。在较窄的玻片上刻有1cm见方的划度2个，两载片间的距离为1.5mm。这样，两个划度便形成了2个麦氏计数室。

5. 毛蚴孵化法 是诊断日本血吸虫及东毕吸虫的方法之一。其依据是血吸虫卵内的毛蚴在适宜的条件下能很快孵出，并基本上按直线运动于水面下，利用这一特性检查毛蚴即可确诊。

取被检粪便30～100g(牛100g)经沉淀集卵法处理，将沉淀倒入500ml三角烧瓶内，加温清水(自来水需脱氯处理)至瓶口，置22～26℃孵化，1h、3h、5h，用肉眼或放大镜分别观察并记录一次。如见水面下有白色点状物做直线来往运动，即是毛蚴，但需与水中一些原虫如草履虫、轮虫等相区别。必要时吸出在显微镜下观察。气温高时，毛蚴孵出迅速，因此，在沉淀处理时应严格掌握换水时间，以免换水时倾去毛蚴造成假阴性结果。也可用1.0%～1.2%食盐水冲洗粪便，以防止毛蚴过早孵出，但孵化时应用清水。

6. 粪便培养与幼虫分离法 圆线虫目所属线虫种类很多，其虫卵在形态上非常相似，很难区别。有时为了区别这些线虫的种类，常将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为幼虫时，再检查幼虫，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。

最常用的方法是在培养皿底部加草纸或滤纸一张，而后将欲培养的粪便加水调成硬糊状，塑成半球形，放于皿内的纸上，并使半球形粪球的顶部略高出平皿边沿，使加盖时与皿盖相接触。将此皿置25℃温箱中，注意保持皿内湿度(应使底部的垫纸保持潮湿状态)。经7天后，多数虫卵即可发育成第三期幼虫，并集中于皿盖上的水滴中。将幼虫吸出置载玻片上，放显微镜下检查。

有些寄生虫(如网尾科线虫)，其虫卵在新排出的粪便中已变为幼虫;类圆属线虫的卵随粪便排出后，在外界温度较高时，经5～12h后，即孵出幼虫。为了提高检出率，常将幼虫从粪便中分离出来进行检查。常用的方法为漏斗幼虫分离法，亦称贝尔曼法。取粪便15～20g，放在漏斗内的金属筛上，漏斗下接一短橡皮管，管下再接一小试管。将粪便放漏斗内铜筛上，不必捣碎，加入40℃温水到淹没粪球为止，静置1 ～3h。此时大部分幼虫游走沉于试管底部。拔取底部小试管，取其沉渣，在显微镜下检查。

四、体表虫体检查法

寄生于动物体表的寄生虫主要有蜱、螨、虱等。对于它们的检查，可采用肉眼观察和显微镜观察相结合的方法。

蜱寄生于动物体表，个体较大，通过肉眼观察即可发现。

螨和虱有些个体较小，常需刮取皮屑，于微镜下寻找虫体或卵。

刮取皮屑的方法甚为重要，应选择患病皮肤与健康皮肤交界处，这里的螨较多。刮取时先剪毛，取凸刃小刀，在酒精灯上消毒，使刀刃与皮肤表面垂直，刮取皮屑，直到皮肤轻微出血(此点对检查寄生于皮内的疥螨尤为重要)。

在野外进行工作时，为了避免风将刮下的皮屑吹去，可根据所采用的检查方法的不同，在刀上先蘸一些水或5%的甘油溶液，这样，可使皮屑黏附在刀的上。将刮下的皮屑集中于培养皿或试管内，带回供检查。

蠕形螨病，可用力挤压病变部，挤出脓液，将脓液摊于载玻片上供检查。

将刮下的皮屑，放于载玻片上，滴加50%甘油溶液，覆以另一张载玻片。搓压玻片使病料散开，分开载玻片，置显微镜下检查。

为了在较多的病料中，检出其中较少的虫体，而提高检出率，可采用浓集法。先取较多的病料，置于试管中，加入10%氢氧化钠溶液。浸泡过夜(如急待检查可在酒精上煮数分钟)，使皮屑溶解，虫体自皮屑中分离出来。而后待其自然沉淀(或以2 000r/min的速度离心沉淀5min)，虫体即沉于管底，弃去上层液，吸取沉渣检查。也可将病料浸入40～45℃的温水里，置恒温箱中，1～2h后，将其倾入表面玻璃上，解剖镜下检查。活螨在温热的作用下，由皮屑内爬出，集结成团，沉于水底部。还可将刮取到的干的病料，放于培养皿内，加盖。将培养皿放于盛有40～45℃温水的杯上，经10～15min后，将皿翻转，则虫体与少量皮屑黏附于皿底，大量皮屑则落于皿盖上。取皿底检查。可以反复进行如上操作。本法可在镜下收集到与皮屑分离的虫体，供制作玻片标本用。

五、生殖道虫体检查

寄生于生殖道的虫体主要有牛胎儿毛滴虫和马媾疫锥虫。

1. 牛胎儿毛滴虫检查

(1)病料采集 牛胎儿毛滴虫存在于病母牛的阴道与子宫的分泌物，流产胎儿的羊水、羊膜或第四胃内容物中，也存在于公牛的包皮鞘内，应采取以上各处的病料寻找虫体。

由于虫体的检定，常以见到运动活泼的虫体为准，故在采集病料时必须尽可能地避免污染，以免其他鞭毛虫混入病料造成误诊。采集用的器皿和冲洗液等应加热使接近体温，否则虫体骤然遇冷会失去活动力或死亡。冲洗液应采用以玻璃蒸馏装置制备的蒸馏水配制生理盐水，以保证冲洗液中不含金属离子，减少金属离子对虫体的影响。病料采集后应尽快进行检查。

由母畜采集病料，是取阴道分泌的透明黏液，以直接自阴道内采取为良好，建议用一根长45cm，直径1.0cm的玻璃管，在距一端的12cm处，弯成150°，而后消毒备用。使用时将管的“短臂”插入受检畜的阴道，另端接一橡皮管并抽吸，少量阴道黏液即可吸入管内。取出玻管，两端塞以棉球，带回实验室检查。

收集公牛包皮冲洗液，应先准备100～150ml加温到30～35℃的生理盐水，用针筒注入包皮腔。用手指将包皮口捏紧，用另一手按摩包皮后部，而后放松手指，将液体收集于广口瓶中待查。

流产胎儿，可取其第四胃内容物，胸水或腹水检查。

(2)检查法 检查时应将收集到的病料，立即放于载玻片上，并防止材料干燥。对浓稠的阴道黏液，检查前最好以生理盐水稀释2～3倍，羊水或包皮洗涤物最好先以2 000r/min的速度离心沉淀5min，而后以沉淀物制片检查。未染色的标本主要检查活动的虫体，在显微镜下可见其长度略大于一般的白细胞，能清楚地见到波动膜，有时尚可见到鞭毛，在虫体内部可见含有一个圆形或椭圆形的有强折光性的核。波动膜的发现，常作为本虫与其他一些非致病性鞭毛虫和纤毛虫在形态上相区别的依据。也可将标本固定，用姬姆萨染液或苏木素染色后检查。

2. 马媾疫锥虫检查法 马媾疫锥虫在末梢血液中很少出现，因此血液学检查在马媾疫诊断上的用处不大。检查材料主要应采取浮肿部皮肤或丘疹的抽出液，尿道及阴道的黏膜刮取物，特别在黏膜刮取物中最易发现虫体。

采取病料时，浮肿液和皮肤丘疹液用消毒的注射器抽取，为了防止吸入血液发生凝固，可于注射器内先吸入适量的2%枸橼酸钠生理盐水。马阴道黏膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴道，再用长柄锐匙在其黏膜有炎症的部位刮取，刮时应稍用力，使刮取物微带血液，则其中容易检到锥虫。采取公马尿道刮取物时，应先将马保定，左手伸入包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。

以上所采的病料，均可加适当量的生理盐水，置载玻片上，覆以盖玻片，制成压滴标本检查;也可制成抹片，用姬姆萨液染色后检查。

也可用灭菌纱布，以生理盐水浸湿，用敷料钳夹持，插入公马尿道或母马阴道，擦洗后，取出纱布，洗入无菌生理盐水中，将盐水离心沉淀，取沉淀物检查，方法同上。

六、血液和组织内虫体检查法

用消毒过的针头自耳静脉或颈静脉采取血液。此法适用于检查寄生于血液中的伊氏锥虫、梨形虫和住白细胞虫。

1. 鲜血压滴标本检查 自动物耳静脉或颈静脉采血，将采出的血液滴在洁净的载玻片上，加等量的生理盐水与之混合，覆以盖玻片，立即放显微镜下用低倍镜检查，发现有运动的可疑虫体时，可再换高倍镜检查。由于虫体未染色，检查时应使视野中的光线弱些。本法适用于检查伊氏锥虫。

2. 涂片染色标本检查 采血，滴于载玻片之一端，按常规推制成血片，并使晾干。滴甲醇2～3滴于血膜上，使其固定，用姬姆萨或瑞氏液染色。染后用油浸镜头检查。本法适用于各种血液原虫。

3. 虫体浓集法 上法虽然可以查到血液中的原虫，但血液中的虫体较少时，则不易查出虫体。为此，常先进行集虫，再行制片检查。其操作过程是，采病畜抗凝血6～7ml，以500r/min的速度，离心5 min，使其中大部分红细胞沉降;而后将含有少量红细胞，白细胞和虫体的上层血浆移入另一离心管中，补加一些生理盐水，2500r/min的速度离心10min。取此沉淀物制成抹片，按上述染色法染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。其原理是锥虫和感染有梨形虫的红细胞的密度较轻，所以在第一次沉淀时，正常红细胞下降，而锥虫和感染有梨形虫的红细胞尚悬浮在血浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。

对于血液中的微丝蚴，也可用虫体浓集法。方法是采血于离心管中。加入5%醋酸溶液以溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉淀检查。

4. 组织内虫体检查法 有些原虫可以在动物身体的不同组织内寄生。一般在死后剖检时，取一小块组织，以其切面在载玻片上做成抹片、触片，或将小块组织固定后制成组织切片，染色检查。抹片或触片可用瑞氏或姬姆萨染液染色。

泰勒原虫病的病畜，常呈现局部的体表淋巴结肿大，采取淋巴结穿刺物，进行显微镜检查以寻找病原体对本病的早期诊断很有帮助。其法是：首先将病畜保定，用右手将肿大的淋巴结稍向上方推移，并用左手固定淋巴结，局部剪毛，消毒，以10ml注射器和较粗的针头，刺入淋巴结，抽取淋巴组织，拨出针头，将针头内容物推挤到载玻片上，涂上抹片，固定，染色(与血片染色法同)，镜检，可以找到柯赫蓝体。

家畜患弓形体病时，除死后可在一些组织中找到包囊体和滋养体外，生前诊断可取腹水，检查其中有否滋养体存在。收集腹水，猪可采取侧卧保定，穿刺部位在白线下侧脐的后方(公畜)或前方(母畜)1～2cm处，穿刺时局部先消毒，将皮肤推向一侧，针头以略倾斜的方向向下刺入，深度2～4cm，针头刺入腹腔后会感到阻力骤减，之后有腹水流出。有时针头被网膜或肠管堵住，可用针芯消除此障碍。取得腹水可在载玻片上抹片，以瑞氏液或姬姆萨液染色后检查。

旋毛虫的幼虫寄生于横纹肌中。传统的方法为镜检法。从猪或其他动物的左右膈肌各切取小块肌肉，除去肌膜和脂肪，在不同的部位剪取麦粒大小的肉粒，夹于两张载玻片之间，压紧，压薄，先用肉眼对光观察，有无针尖大小的包囊，然后再置解剖镜或低倍显微镜下观察。

七、动物接种法

有些原生动物，在病畜体内用上述显微镜检查法不易查到，为了确诊常采用动物接种试验。接种用的病料、被接种的动物种类和接种的途径均依病的种类不同而异。

八、免疫学诊断方法

寄生虫作为病原体，其在宿主体内生长、发育和繁殖过程中的代谢产物和虫体死亡崩解产物，都在宿主体内具有抗原作用，从而刺激宿主机体产生相应的抗体。利用抗原抗体间产生的反应，便可对寄生虫病或寄生虫感染做出诊断。

已报道的寄生虫免疫学诊断方法很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、放射免疫分析技术、免疫印迹技术等。

1. 皮内试验 皮内试验是利用宿主的速发型变态反应，将特异抗原液注入皮内，观测皮丘及红晕反应以判断有无特异性抗体(IgE)存在的试验。皮内试验使用的抗原多为酸溶性蛋白抗原。该法在棘球蚴病、弓形体病、旋毛虫病、片形吸虫病、肺吸虫病、血吸虫病、多头蚴病、猪囊虫病、冠尾线虫病、后圆线虫病、蛔虫病、马脑脊髓丝虫病、锥虫病等曾有试用的介绍，具有敏感性高，操作简便，反应和读取结果快速，不需特殊仪器设备，适宜现场应用等优点。

(1)棘球蚴病皮内试验 动物皮内(最好是颈部)注射0.1～0.2ml抗原，注射后5～10min(最迟不超过0.5～1h)内，在注射部位出现红肿，红肿面积直径达5～20mm者即为阳性。试验的同时，在距注射部位一定距离处用等量生理盐水同法注射以做对照。

(2)旋毛虫病皮内试验 取抗原0.2ml，注射于猪耳后颈部皮内，然后观察皮肤反应。于注射后10～20min内，注射的局部水疱变红变暗，形成直径1cm以上的暗紫红色斑点，并保持30min以上者为阳性反应。注射的局部水疱无变化，在10min左右消失。或仅出现淡红色斑点，但在30min内很快消失者为阴性反应。

2. 沉淀试验 宿主感染寄生虫后，其血清中即含有特异性抗体，此抗体与病原体的抗原相结合而产生沉淀，可由此测定家畜体内是否存在抗体以判定家畜是否感染某种寄生虫。

(1)免疫扩散沉淀试验 免疫扩散沉淀试验的原理是当可溶性抗原与其相应的抗体在溶液或凝胶中彼此接触时所产生的抗原抗体复合物，可成为肉眼可见的不溶性沉淀物。可据此进行抗原、抗体的定性及定量分析。但在寄生虫病临床诊断中，多采用已知抗原测抗体以判定被检者血清中是否含有抗体或被某种寄生虫感染。

一般说来，免疫扩散沉淀试验都具有比较简单、方便、易行，且准确、可靠、重复性好等优点。可以用免疫扩散沉淀试验做诊断的寄生虫病有马媾疫、伊氏锥虫病、巴贝西虫病、冠尾线虫病、旋毛虫病、片形吸虫病、血吸虫病等。现将琼脂扩散试验介绍如下。

凝胶平板时尽量一次倒成，使表面平整，厚薄均匀。待琼脂层凝固后，以直径5～8mm的打孔器在琼脂平板上打孔，周孔距中央孔5～6mm。打孔后，用尖头镊子或解剖针挑出孔中的琼脂块。将平板在酒精灯上不停转动，适当加热，使底部凝胶熔化，封闭孔底即成。将平板上各孔编号。用移液管吸取抗原注入中央孔内;然后向周围四孔分别加入待检血清;留下二孔分别加标准阳性和阴性血清。各孔滴加量以加满但不溢出为宜。将平板放在室温下(22℃以上)或25～30℃恒温箱中，24h后检查，在抗原孔与检血清孔之间出现白色沉淀线者为阳性反应，无沉淀线者为阴性反应。

(2)活体沉淀试验 活体沉淀试验是寄生虫病所特有的免疫诊断方法。其是将寄生虫的活幼虫或虫卵放于被检血清内，如果在幼虫或虫卵周围或某一部位形成沉淀，则表示被检者血清内已含有抗体或被检者已受该寄生虫感染。

1)环卵沉淀试验 沉淀试验是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验。卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出，与试样血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀。试验时，在载玻片或凹玻片上滴加被检血清一滴，挑取适量鲜卵或干卵(100～150枚，从感染动物肝脏分离)混于血清中，覆以盖玻片，四周用石蜡密封，置37℃恒温24～48h后，低倍镜下检查结果。典型的阳性反应为泡状、指状、片状或细长弯曲状的折光性沉淀物，边缘整齐，与卵壳牢固粘连。阴性反应必须看完全片。阳性者，根据反应卵的百分率和反应强度分别判定：“+”，卵周出现泡状、指状沉淀物的面积小于卵周面积的1/4，片状沉淀物小于1/2，细长曲带状沉淀物不足卵的长径。“++”，泡状、指状沉淀物总面积大于卵周面积1/4，片状沉淀物大于1/2，曲带状沉淀物相当或超过卵的长径。“+++”，泡状、指状沉淀物大于卵周面积的1/2，片状沉淀物面积等于或超过卵的大小，曲带状沉淀物超过卵长径数倍。

2)蛔虫环幼沉淀试验 用人工感染蛔虫的小白鼠，6天后自肺内分离幼虫，经生理盐水洗净后，放于数滴被检血清中，置37℃温箱中24h后，如在蛔虫幼虫口部和肛门等处出现泡沫状或颗粒状沉淀物则判为阳性。此法可用于诊断蛔虫幼虫移行期所致的寄生虫性肺炎。