八、病毒学检查

(一)病毒分离用样品的采集与保存

样品的现场处理如下：

喉、鼻咽或直肠拭子。将其放入灭菌管中，加入2ml Hank’s平衡盐溶液(pH7.2)，其中含蛋白稳定剂(0.5%明胶或牛血清白蛋白)和复合抗生素(见组织培养抗生素的配制)。

粪便样品。直接放入灭菌试管中或加入等量含复合抗生素的上述平衡盐溶液。

尿或腹水等体液。直接收入灭菌瓶中。

血液样品。每个病宠物抽取10～15ml全血，使其自然凝固分离血清。将血清置于灭菌瓶中于低温冰箱中保存。待2～3周后再抽血一次分离血清。有时也用柠檬酸钠或肝素抗凝血或脱纤血进行病毒分离或血细胞分类。

组织器官样品。死后立即采集，直接放入灭菌瓶中，不加防腐剂。若样品不能当天使用，可用50%缓冲甘油(用pH 7.2 ank’s平衡盐溶液或PBS配制，含复合抗生素)保存。绝大多数病毒是不稳定的，样品一经采集要尽快冷藏。现场采集的样品要尽快用冷藏瓶(加干冰或冰块)将样品送到实验室检验或置低温冰箱保存。如使用干冰应特别注意将样品密封好，以防二氧化碳(CO2)窜入样品，因为有的病毒对酸很敏感(如口蹄疫病毒)。如无法获得干冰或冰，可用冷水加氯化铵按3：1的比率倒入冷藏瓶中，溶解后将密封好的样品放入其中。不能及时检验的样品，要保存于-70℃以下。一般忌放-20℃(该温度对有些病毒活力有影响)保存。

(二)病毒分离前样品的实验室处理方法

病毒含量较高的浸出液或体液样品，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

1.组织器官样品的处理

用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1～2ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1～2ml继续研磨，逐渐制成10%～20%的悬液。加入复合抗生素; 以800g离心15分钟;取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩(见6)。

2.粪便样品的处理

加4g粪便于16ml Hank’s平衡盐溶液中制成20%的悬液; 于密闭的容器中强烈振荡30分钟，如果可能则加入玻璃球; 以6000g低温离心30分钟，取上清液再次重复离心; 用450nm的微孔滤膜过滤; 加2倍浓度的复合抗生素，然后直接用于分离病毒，或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

3.无菌的体液(腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等)和鸡胚液样品

可不做处理直接用于病毒分离。

注： Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。

4.样品的特殊除菌处理

样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。

乙醚除菌： 对有些病毒(如肠道病毒、腺病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力)样品，可等量加入冷乙醚，悬液中充分振荡，置4℃过夜。取下层水相分离病毒。

过滤除菌： 可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或200nm孔径混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。

离心除菌： 用低温高速离心机以1800r/min离心20分钟，可沉淀除去细菌，而病毒(小于100nm)在上清液中。必要时转移离心管重复离心1次。

5.待检样品中病毒的浓缩

对病毒含量很少的样品，普通方法不易检测或分离出病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下：

聚乙二醇(PEG)浓缩法： 将分子量6000的PEG逐步加入经处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000g离心15分钟，沉淀用少量含复合抗生素的Hank’s平衡盐溶液重悬。必要时，用450nm微孔滤器除去真菌孢子。

硫酸铵浓缩法： 将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经处理的样品溶液中边加边搅拌，置4℃过夜。离心同上。

超滤器浓缩法： 是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。详见实验仪器。

超速离心浓缩法： 以40000r/min离心60～120分钟，绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。

6.病毒分离样品脂类物质的去除

有些样品(如组织样品)脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂加入样品中，强烈振荡后，1000g离心5分钟，脂类和大量非病毒蛋白保留在有机液相中，病毒留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抵抗性。

(三)实验动物与病毒分离

1.实验动物在病毒学中的应用

分离病毒，通过实验动物来扩增病毒，使其能够用普通方法鉴定病毒。

借助感染范围鉴定病毒。

繁殖病毒制备诊断抗原或疫苗。

病毒的免疫学和血清学试验。

制备免疫血清。

病毒感染实验研究。

2. 实验动物的分级

国内的实验动物目前分4级：

一级实验动物： 也称普通动物(CV)，饲养于开放系统检疫或屏障系统，要求无主要人畜共患病病原体和严重危害动物种群的微生物和寄生虫。

二级实验动物：也称清洁动物(CCV)，饲养于简易屏障系统或屏障系统。要求无一级实验动物应排除的微生物、寄生虫和危害本动物种群的微生物和寄生虫。

三级实验动物： 也称无特定病原体动物(SPF)，饲养于隔离系统或屏障，要求无一、二级动物应排除的和对动物本身有危害或干扰实验结果的微生物和寄生虫。

四级动物： 也称无菌动物(GF)，饲养于隔离系统，要求无可检出的微生物或所有非植入的微生物和寄生虫。

另外还有悉生动物(GN)，又称已知病原体动物，是指体内带有的微生物完全明确的动物。悉生动物是由无菌动物衍生而来，此种动物原是无菌动物，系人为地将指定的微生物丛投入其体内，按投给微生物的种类又分为单菌(Monoxenie)、双菌(Dixenie)、三菌(Trixenie)或多菌(Polyxenie)动物。

3.实验动物的选择

兽医学上常用于分离病毒的实验动物有家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡胚等，也常用自然易感动物如家畜、家禽等。选择用于分离病毒的实验动物的原则，是要确认选择的实验动物的种类、年龄、性别对拟检查的病毒有最高的敏感性。实验动物的级别选择可根据实验性质而定。

4.实验动物的接种

实验动物的接种必须选择对拟检查的病毒最敏感的途径，否则，即使接入大量病毒也有可能造成感染失败。分离不同病毒选择的实验动物及接种途径各有所不同。本节只介绍新生小鼠和鸡胚的常用接种途径。

新生小鼠的几种接种途径：新生小鼠对多种病毒易感，是一种很常用的实验动物。一般选择出生24～48小时的小鼠。常用以下三种途径： 皮下接种法，接种量0.1ml/只; 脑内接种法，接种量0.03ml/只;腹腔接种法，接种量0.01ml/只。

鼠组织毒的收获： 接种后每天观察2次，以及时发现死亡、麻痹等病症。弃掉24小时内死亡小鼠，收集死亡或出现麻痹症状的小鼠脑和胴体，制成10%的组织悬液用于诊断、鉴定，或接种适宜的组织细胞。

鸡胚的常用接种途径： 用鸡胚分离病毒虽然是一种较为原始的方法，但由于其具有经济、方便以及适用范围广等优点，至今仍然是应用最广泛的方法之一。常有以下几种接种途径：

(1)羊膜腔或尿囊腔的接种 选用7～13日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒表面。从气室上端打孔，在观察灯上用带有6号针头的注射器从孔中插入至尿囊腔和(或)羊膜腔中，接入0.1～0.2ml样品。羊膜腔的接种应注意向胚胎方向刺入。刺破羊膜腔的依据就是胚胎发生突然的运动，然后稍向回抽针，注入样品。每份样品接3～4枚鸡胚。用胶带或石蜡封孔，将气室向上放置，孵育于35～37℃。每日用观察灯观察，弃掉24小时内死亡的鸡胚。收集24小时以后死亡的鸡胚，或72～120小时收集活胚。羊水和尿囊液的收集： 将鸡胚置4℃下2～4小时，用碘酒和酒精消毒表面，剥去气室上的蛋壳，用剪刀或镊子撕破壳膜和绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液。吸完尿囊液后，用镊子夹住羊膜，用吸管穿入羊膜腔吸取羊水。

(2)绒毛尿囊膜接种 选择9～12日龄的鸡胚，用5%石炭酸进行消毒。不用碘酒消毒，因为酒精溶液可经卵壳吸收，并在绒毛膜上产生病变。观察灯上选择血管较少的一侧，用电烙铁在卵壳上烙一个烤焦圈，或用自制针头钻(无针尖)沿定位线钻一个直径5mm的圆圈，但不能钻透。用刀片挑起一小片卵壳。另外，在气室上方用针穿另外一个孔。用一橡皮吸球从气室上的小孔轻吸气使胚内形成负压，使侧面开口处的绒毛尿囊膜下陷。从侧面的开口用注射器通过壳膜插入约5mm深，将0.05ml的样点滴在下陷的绒毛囊膜上。缓慢抽出针头，用胶带将鸡胚上的两个开口全部封住。将气室端向上，于35～37℃孵育。每日观察接种的鸡胚，弃掉24小时内死亡的鸡胚。绒毛尿囊膜的收获： 将鸡胚放于卵架上，用碘酒和酒精消毒表面。从气室端剥去卵壳，用镊子夹住绒毛尿囊膜(或先将鸡胚倾入平皿中后，再用镊子夹住绒毛尿囊膜)，用剪刀剪下绒毛尿囊膜。将绒毛尿囊膜平铺在平皿中，加入几毫升Hank’s平衡盐溶液或PBS，置于暗色平面上，以便计数痘斑或病斑。

另外，也可以采用简便接种方法，即直接从气室端打破卵壳，用眼科镊撕去一小片绒毛尿囊膜上的内壳膜，然后滴加样品溶液。

(3)黄囊接种法 选用5～7日龄鸡胚(此时期卵黄囊大，易接种，且有较大的表面积供病原体繁殖)，于观察灯上画出气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，用碘酊和酒精消毒气室端。用针头钻在气室中央锥一小孔，用带有6号针头的注射器将样品沿小孔刺入约3cm，注入0.1～0.2ml接种物于卵黄囊内，随后用胶带或石蜡封孔。置孵化箱内继续孵育，每天翻孵2次。弃掉24小时内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24小时内死亡)。卵黄囊的收获： 用碘酒和酒精消毒表面，用镊子去掉气室上的卵壳，用另一把灭菌镊子夹出卵黄囊(黄色容易辨认)放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入皿中，然后剥出卵黄囊。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。

(4)鸡胚静脉接种 选用11～13日龄鸡胚，在观察灯上标出一根大静脉。常规法消毒后，去除静脉上方的一小块卵壳。滴加一小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。用带有4号针头的注射器将样品顺血流方向插入静脉内后注射。注射量为0.025～0.05ml。