将酶催化反应的敏感性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种血清学检测技术。酶的催化过程有两种基本形式： ①E+S⇌(ES)⇌E+P， E为酶， S为酶作用的底物， P为分解后产物， 如S为无色化合物，P为有色化合物， 即可用呈色反应显示酶的存在。②E+S⇌(ES)， (ES)+D1⇌E+P+D2， 此类催化反应中必须同时存在供氢体D1。在基质水解时，D1由还原型变为氧化型D2，如D1为无色化合物，D2为有色化合物， 在催化作用中即呈现颜色反应。

此项技术的基本程序是将酶分子与抗体或抗原共价结合， 此种结合既不改变抗体的免疫反应活性， 也不影响酶的催化活性。此标记物可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的相应抗原或抗体结合，洗涤后，滴加底物溶液， 如有酶存在时即可出现呈色反应， 呈色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量呈正比， 此种呈色反应可用肉眼、显微镜观察或用分光光度计测定。

用于标记的酶最常用的是辣根过氧化物酶， 简称HRP， 其底物为过氧化氢， 催化时需要供氢体(即显色剂)。常用的供氢体有3，3-二氨基联苯胺(DAB)和邻苯二胺(OPD)。前者适用于免疫组化法， 反应后的氧化型中间体迅速聚合， 形成不溶性棕色化合物， 可用于光学显微镜检查， 这种多聚物还能还原和螯合四氧化锇， 形成具电子密度的产物， 也适用于电子显微镜检查。后者适用于免疫酶测定技术， 酶解产物呈橙色， 具可溶性， 可用肉眼观察或酶标仪测定， 敏感性高。

该项技术种类繁多， 常用者大致包括：

免疫酶组化染色法 用于检测组织中抗原或抗体的定位。标本在制作过程中尚需浸于0.3%过氧化氢中， 室温处理15～30分钟， 以消除细胞内的过氧化物酶。

染色方法包括： ①直接法。以酶标抗体直接着染标本， 37℃ 30分钟，PBS洗涤3次， 然后浸于含有底物和显色剂(如酶为HRP， 则底物为过氧化氢， 常用显色剂为DAB)的反应液中， 通过显色反应后， 即可在显微镜下观察， 抗原所在部位呈棕黄色; 亦可用常规染料作反衬染色， 则细胞结构更为清晰， 有利于抗原定位。②间接法。先将标本用未标记的抗血清处理，洗涤后再滴加与抗血清中IgG相应的酶标抗抗体或能与之结合的酶标葡萄球菌A蛋白(SPA)， 然后经显色处理， 即可显示抗原抗体复合物的所在部位。此法除用于抗原定位外，还可用已知抗原片来检验未知抗体。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosar-bent assay， ELISA) 其基本过程是先将抗原(或抗体)吸附于固相载体， 在其上进行免疫酶染色，显色后用肉眼、分光光度计或专用酶标测定仪判定结果。试验程序包括： ①包板： 将提纯的抗原(或抗体)牢固地吸附在聚苯乙烯微孔滴定板上。按事先测定的最适包板浓度， 将其稀释于弱碱性包板液(通常用0.1摩尔/升。pH9.6碳酸钠缓冲液)中，置4℃过夜或37℃ 2～3小时，可贮存3周，用前充分洗涤。为避免包板后尚残留未吸附部位，必要时尚需用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)处理30分钟，以封闭固相载体表面残留的活性部位， 降低非特异吸附造成的误差。②吸附处理： 此法的核心是利用抗原抗体的特异性结合， 在固相载体上进行吸附处理， 可以是单层，也可以是两层或多层， 每加一层处理(通常用37℃2小时)后， 必须充分洗涤， 但最上一层必须是酶标记物，各层次之间必须能以非共价键相互结合，如抗原与抗体、抗体与抗抗体和抗体与葡萄球菌A蛋白(SPA)等， 试验时如缺少任何一个层次， 则其上的各层均无法吸附， 而呈阴性反应。试验所用各层次的试剂浓度均需事先测定， 以选择最佳工作浓度。③底物呈色： 选用反应后产物为水溶性色素的显色剂， 最常用的是OPD， 对光敏感， 底物溶液应在用前配制，滴加后避光作用20～30分钟， 每孔加浓硫酸终止反应。④结果判定： 肉眼判定一般作定性用， 欲获得精确结果， 需用ELISA检测仪测定每孔光密度(OD)值， 所用波长随酶和底物不同而异。试管应设阳性和阴性血清对照， 滴定板的第10列孔为空白对照，在测OD值时用以调零， 抗原对照可根据需要而定。

结果的记录方法视需要而定。①用“+”或“-”表示。肉眼观察， 凡反应颜色比正常对照孔深者，或OD值≧阴性标本均值加2～3个标准差(事先测定大量阴性标本后求得的)者判为阳性。②以终点滴度表示，出现阳性的最高稀释度即为该样本的ELISA效价。③以P/N比表示，凡待检样本和阴性对照(N)OD值之比大于1.5、2或3者判为阳性。④以单位表示，先测定一已知单位的阳性标准血清，以OD值为纵坐标，单位数为横坐标，绘制出标准曲线，根据未知标本的OD值即可在坐标上找出相应的单位数，乘以稀释倍数，即得该未知标本的单位数。

ELISA方法很多，最常用的方法及反应层次为：①间接法。其层次为抗原+抗体(待测)+酶标抗抗体;用于测定抗体;②双抗体法。层次为抗体+抗原(待测)+酶标抗体;用于测定大分子抗原;③竞争法。层次为抗体+定量酶标记抗原和待测抗原的混合液，对照仅加酶标记抗原，显色后，颜色越浅抗原量越多，用于测小分子半抗原(图)。此外尚有双夹心法，酶—抗酶抗体法和酶标SPA法等。

酶联免疫吸附试验

Ag.抗原;Ab1.特异性抗体;Ab2.

抗抗体;E.酶

黑色小点为底物酶解后的色素， 白色小环为未酶解的底物

限量抗原底物珠法(defined antigen substrate sphere，DASS) 以溴化氰活化的琼脂糖4B(sepharose 4B)为载体，将抗体或抗原吸附其上，制成免疫微珠，在此微珠上进行ELISA或免疫酶组化染色。①试管法：将定量微珠加入试管内，按ELISA法进行吸附处理，底物显色后，观察颜色深浅，或用ELISA测定仪测定OD值。本法加入微珠数不易恒定，洗涤过程中又易丢失，故不常用。②玻片法：在划成若干小区的清洁玻片上用2%明胶涂布薄层晾干2小时后，滴加已吸附抗原(或抗体)的微珠，每小区约10～20粒，再干燥2小时以上，使充分粘附，然后在玻片上进行吸附处理，用DAB显色，在显微镜下检查微珠是否着色，如对照微珠不着色，而样品珠着色，即为阳性。

均质酶免疫测定(homogeneous enzyme immu-noassay，HEI) 将抗原、抗体、酶标记物和底物加在一起，反应结束后，即可直接测定结果，操作简便，重复性好，无须事先包板，适于一般实验室及野外条件下进行测试。HEI的具体方法种类很多，其原理、结果检测方法和适用范围也各不相同。其敏感性已接近放射免疫测定(RIA)。其缺点是原材料不易取得，标记物和各种试剂准备困难。

酶放大免疫测定(enzyme multiplied immunoas-say，EMI) 视抗体对标记抗原中酶的作用不同又可分为两种：①抗体增强酶活性法：某些酶，如苹果酸脱氢酶(MDH)被用以标记某些半抗原(如甲状腺素T4)时，此标记物中的抗原仍保持与抗体的结合能力，而MDH的酶活性则受到强烈抑制，但当标记物中抗原与抗体结合后，MDH的酶活性又可恢复，将待测抗原、标记抗原、抗体和底物溶液(L-苹果酶和辅酶I)依次加入试管，即可显色。待测标本中抗原含量愈高，颜色愈浅，两者呈负相关。②抗体抑制酶活性法;另一些酶，如溶菌酶，与半抗原结合后，酶活性可保持不变，当标记物中抗原与抗体结合，则酶活性被抑制，此法以对溶菌酶敏感的微球菌为底物，将待测标本、标记抗原、抗体和底物混合作用后，即可用比浊法测定菌体溶解后的浊度变化，根据竞争曲线计算出标本中抗原含量。

辅基标记免疫测定(prosthetic group label im-munoassay，PGLIA) 用酶的辅基标记抗原，标记物仍能与酶蛋白结合，恢复酶活性，一旦与抗体结合后，则不能与酶蛋白结合而丧失酶活性。葡萄糖氧化酶(GOD)的辅基是黄素腺嘌呤双核苷酸(FAD)。如将FAD标记在抗原分子上，即可进行PGLIA试验。在此设计中，GOD的活性是通过另一组配对酶——过氧化物酶(HRP)来显示的。GOD氧化葡萄糖产生的H2O2可以作为HRP的底物。

试验时依次加入待测抗原、抗体、标记抗原、葡萄糖酶蛋白和HRP及显色剂(OPD)，如无抗原，则抗体与标记抗原结合，其中FAD不能与酶蛋白结合成GOD，因而不产生H2O2，结果不显色。反之则显色;颜色深浅与抗原量呈正相关。该法可用于检测小分子半抗原，也可用于检测大分子蛋白质抗原，且可建立纸片比色的PGLIA卡。

标记抗体酶抑制免疫测定(antihodylabeled en-zyme inhibition immunoassay，ALEII) 此法是用磷酯酶C标记抗体，游离的标记物仍保持酶活性，可水解红细胞壁中的磷脂，使红细胞溶解。但当标记物中的抗体与抗原结合后，即能抑制酶活性。将待测抗原、标记抗体和红细胞混合作用后，用分光光度计(540纳米)测定红细胞裂解后的血红蛋白量，即可计算抗原含量。二者呈负相关。此法可用以测定大分子抗原。