病原学诊断主要指细菌与病毒等病原微生物的分离鉴定，是传染病诊断技术的基础，也是一项很基本的确诊方法。

(一)细菌的分离与鉴定

1.细菌培养基　培养基是按照微生物生长要求制成的一种人工营养制品，主要作为繁殖细菌微生物、分离细菌微生物、鉴定细菌微生物、保存和研究细菌微生物以及制造生物制品等用。培养细菌必须有适于细菌生长繁殖的培养基。不同种类的细菌对营养的要求有显著的差别。培养基是用人工的方法，将多种营养物质根据各种细菌生长的需要而合成的一种混合营养料。

2.培养基的制备　目前通常采用现成的各种干粉培养基成品，用蒸馏水配制而成，此种培养基使用方便，可直接用于各种培养基的制备。

(1)普通培养基：①营养琼脂：取营养琼脂粉45克，加入1 000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解，121 ℃高压灭菌15分钟，冷却至50 ℃左右分装试管、摆成斜面或倾注于平皿制成。置37 ℃培养箱过夜，有污染者废弃，无菌者置冰箱备用。一般细菌生长的分离、纯培养、观察菌落性状及保存菌种用，为特殊培养基的基础。②鲜血琼脂：以无菌手术采取健康动物血液，加到盛5%柠檬酸钠溶液的容器中(血与抗凝剂之比为9∶1)，混匀;或加到盛有灭菌玻璃珠的容器里，反复摇动多次制成脱纤血，制备成无菌鲜血，置冰箱中备用。将灭菌后的营养琼脂冷却至45～50 ℃，按5%～10%加入无菌鲜血，混匀，分装及无菌检验同普通营养琼脂。

(2)特殊培养基：主要是麦康凯琼脂，制作方法为：取麦康凯琼脂粉55克，加入1 000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解、灭菌、分装及无菌检验同普通营养琼脂。是肠道菌培养常用的培养基。其他还有三糖铁琼脂、SS琼脂等。

3.细菌的培养

(1)病料的处理：采集的病料，在接种培养前，应对其性状进行观察并做记录，各种病料在分离培养前均应涂片，做革兰氏染色、镜检，以了解细菌的形态、染色特性，并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果，对病料中可能含有的病原菌做出初步的估计。如果病料是病变组织，又是用无菌方法采集的，在接种前一般无需做特别处理。但如果病料被杂菌污染严重，则需根据要分离的病原菌的特性，采用一些对病原菌无害但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法，以抑制杂菌生长。有些病料(如乳汁、尿等)含菌太少，则应先做集菌处理，然后接种，以提高检出率，其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物;过滤法取沉积于滤板上表面的病料做培养。

(2)细菌的分离与接种：培养细菌时，须将标本或细菌培养物接种于培养基上，常用接种方法有以下几种：

1)平板画线接种法：本法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板画线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌，分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37 ℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。

2)斜面接种法：采用该法目的是进行纯培养。其方法是从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上画一条直线，再从底部开始向上画曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上画曲线接种。

3)倾注培养法：此法适用于乳汁和尿液等液体标本的细菌计数。其方法是取原标本或经适当稀释[一般是(10～1)～(10～5)倍稀释]的标本1毫升，置于直径9厘米无菌平皿中，倾入已溶化并冷却至50 ℃左右的培养基约15毫升，立即混匀待凝固后倒置于37 ℃培养18～24小时，做菌落计数。

4)其他还有穿刺接种法和液体接种法等。

(3)细菌的培养方法：根据培养细菌的目的和培养物的特性，培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。将已接种过的培养基，置37 ℃培养箱内18～24小时，需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基内生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3～7天直至一个月才能生长。为便于培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石蜡凡士林封固，以防培养基干裂。

4.细菌的鉴定　通过分离培养获得的病原菌，必须达到不含有其他微生物的纯培养程度，才能进行系统鉴定。系统鉴定就是通过对病原菌的形态结构、生长特性、生理生化特性、抗原性和病原性大小等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。微生物鉴定的程序通常是根据其形态、生长、生化特性等定种，最后根据抗原的免疫血清学检测定型。

5.常用的染色方法　常用的染色方法主要有革兰氏染色法、碱性美蓝(亚甲基蓝)染色法、姬姆萨氏染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法等。本书仅介绍革兰氏染色法。

(1)原理：有些细菌的胞浆膜中含有大的高分子核糖核酸镁盐，它在稀释碘液的作用下，可与结晶紫等碱性染料结合成稳定的、不易被酒精脱掉的紫色化合物，当用复红或沙黄等复染时，即不再着色，因此这类细菌被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌。另外，还有一种细菌的胞浆膜中由于没有高分子核糖核酸镁盐，虽然也能被结晶紫等碱性染料染上颜色，但不稳定，易被酒精脱掉，当用复红或沙黄等复染时，则又可被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。

(2)染色方法：首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加较多量的结晶紫乙醇饱和液，经1～2分钟，水洗;加革兰氏碘液，复染1～3分钟，水洗;加95%的酒精脱色，0.5～1分钟，水洗;再加石碳酸复红复染10～30秒，水洗;吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

6.细菌的生化试验　细菌在人工培养条件下，在其生长繁殖过程中，不同菌种所产生的新陈代谢产物各异，表现出不同的生长特性。应用生物化学的方法来检测这些产物的性质，有助于对细菌的鉴别和鉴定。细菌的生化反应在种、型鉴别工作中具有重要价值，是继形态学鉴定之后的又一重要鉴别依据。

7.细菌血清型鉴定及血清学试验　细菌抗原结构比较复杂，有存在于细胞壁的菌体抗原(O抗原)，运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原(H抗原)，它具有不同的种、型特异性。包围于细胞壁外面的抗原称表面抗原，包括种、型特异性很强的荚膜抗原以及Vi抗原和K抗原。此外，还有存在于某些革兰氏阴性杆菌表面的菌毛抗原。从抗原的特异性程度可区分为：一类是存在于属间细菌所共有的共同抗原，这种抗原的存在，只能表明其属性;另一类抗原为特异性抗原，只存在于特定的种、型，是最后确定细菌种、型的重要依据。血清型鉴定是微生物鉴定的特异方法。

8.细菌毒力测定　病原性细菌致病能力的强弱称为毒力。通常毒力越大，致病性就越强。同一种病原菌，因菌株不同，致病力大小也不相同，有强毒、弱毒和无毒株之分。用来表示微生物毒力大小的单位有最小致死量(MLD)或最小感染量(MID)和半数致死量(LD50)或半数感染量(ID50)两种。

(二)病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定是病毒性疾病检疫、诊断和流行病学调查的重要方法之一，对患病的个体或群体进行科学的诊断，以便及时处理;进行检疫，确定是否带有某种病毒病原;对病毒引起的疾病进行流行病学调查、追踪调查或者回顾性调查;对未知新病毒进行分类鉴定等理论研究。

1.病毒分离前样品的实验室处理方法　病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

(1)组织器官样品的处理：用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1～2毫升Hank's平衡盐溶液制成组织悬液，再加1～2毫升继续研磨，逐渐制成10%～20%的悬液;加入复合抗生素;以8 000转/分离心15分钟，取上清液用于病毒分离。

(2)粪便样品的处理：加4克的粪便于16毫升Hank's平衡盐溶液中制成20%的悬液;在密闭的容器中强烈振荡30分钟，如果可能则加入玻璃球;6 000转/分低温离心30分钟，取上清液再次重复离心;用450纳米的微孔滤膜过滤;加2倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再进行病毒分离。

(3)无菌的体液(腹水、骨髓液、脱纤血液、水泡液等)的处理：可不做处理，直接用于病毒分离。

(4)样品的特殊除菌处理：样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合以下方法进行处理。

1)过滤除菌：可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或200纳米孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但病毒有损失。

2)离心除菌：用低温高速离心机以18 000转/分(5.74厘米转子)离心20分钟，可沉淀除去细菌，而病毒(小于100纳米)保持在上清液中。必要时转移离心管重复离心一次。

3)乙醚除菌：对有些病毒可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4 ℃过夜。取下层水相分离病毒。

4)染料普鲁黄除菌：由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。

(5)病毒分离样品脂类物质的去除：有些病毒样品(如组织样品)脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂(如正丁醇、三氯乙烯、氟利昂等)抽提。方法是将预冷的有机溶剂等量加入样品中，强烈振荡后，1 000转/分离心5分钟，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。