一、训练目的

了解布鲁氏菌病的临诊检疫方法;掌握布鲁氏菌病的细菌学、血清学诊断及变态反应等检疫方法。

二、设备和材料

无菌采血试管、采血针头及注射器、皮内注射器及针头、灭菌小试管及试管架、灭菌试管(0.2 mL，1 mL，5 mL，10 mL)、清洁玻璃板、酒精灯、牙签或火柴、布鲁氏菌水解素、5%碘酊棉球、70%酒精棉球、0.5%石碳酸生理盐水或0.5%石碳酸10%氯化钠溶液、布鲁氏菌试管凝集抗原、平板凝集抗原、虎红平板凝集抗原、阳性和阴性血清。

三、训练内容及方法

(一)临诊检疫

1.流行病学

了解患病家畜的种类、发病数量及饲养管理和畜群的免疫接种情况。

2.临诊检查

根据所学此病的症状进行仔细观察，特别注意怀孕后期母畜是否有流产症状，牛流产后有无胎衣滞留，公畜睾丸及附睾有无肿胀、疼痛、硬固。

3.病理变化

对流产胎儿及胎衣仔细观察，结合所学知识注意观察特征性的病理变化。

(二)实验室诊断

1.病原诊断

(1)涂片镜检。材料可无菌采取流产胎儿或其胃内容物、胎衣、阴道分泌物、乳汁、尿液及脓肿中的脓汁等制成抹片，做革兰氏和科兹洛夫斯基染色，若发现呈阴性，鉴别染色为红色的球状杆菌或短小杆菌，即可作出初步的疑似诊断。

(2)分离培养鉴定。将无污染病料接种于含10%马血清的马丁琼脂斜面等适宜培养基上，37 ℃培养2～3 d，如长出湿润、闪光、无色、圆形、隆起、边缘整齐的小菌落，则为布鲁氏菌的可疑菌落。取以上菌落，进行革兰氏和科兹洛夫斯基染色镜检。

污染病料接种于选择性培养基进行分离培养。对于细菌数量较少的病料如乳汁、血液、精液、尿液等，应使用增菌、豚鼠皮下接种或鸡胚卵黄囊接种等方法增菌后再进行分离鉴定。

2.血清学诊断

采血和血清分离。马、牛、羊颈静脉采血，猪以耳静脉采血，局部剪毛并用70%酒精棉球消毒后，无菌采集7～10 mL血液于灭菌试管中，摆成斜面使之凝固，经10～12 h，待析出血清后，用毛细管吸取血清于灭菌小瓶中，封存于冰箱中备用，并作好记录。如不及时应用，按9∶1比例加入5%石碳酸保存，但不得超过15 d。

(1)试管凝集试验：

①操作方法。取反应管6支，立于试管架上，并标明血清和试管号，按表1分别加入0.5%石碳酸生理盐水(羊用0.5%石碳酸10%氯化钠溶液)、被检血清和抗原，充分混合后，放入37 ℃温箱18～20 h，取出后室温静置2 h，记录每管的反应情况，出现50%以上凝集的最高稀释度就是这份血清的凝集价。

实验应该设立以下对照，阴性血清对照，操作步骤与被检血清相同;阳性血清对照：阳性血清稀释到原有滴度，其他同上;抗原对照：已稀释抗原0.5 mL+稀释液0.5 mL。

表1　试管凝集反应表解

②记录反应。++++表示抗原完全凝集而沉淀于管底，上层液体清凉透明。

　　　　　　+++表示75%抗原凝集而沉淀，液体悬浮25%抗原而稍混浊。

　　　　　　++表示50%抗原凝集而沉淀，液体悬浮50%抗原而半透明。

　　　　　　+表示35%抗原凝集而沉淀，液体悬浮75%抗原而较混浊。

　　　　　　-表示抗原完全不凝集，液体完全混浊。

③结果判定。牛、马、骆驼血清凝集价在1∶100以上，猪、山羊、绵羊和狗在1∶50以上，判定为阳性。牛、马、骆驼血清凝集价在1∶50以上，猪、山羊、绵羊和狗在1∶25以上，判定为可疑。可疑家畜经过3～4周重检，牛羊重检仍然为可疑，可判定为阳性，猪马重检仍然为可疑，但是无临床症状判定为阴性。

(2)平板凝集试验：

①操作方法。用平板凝集试验箱或清洁玻璃板一块，画出若干4 cm2大小的方格，横排五格，纵排可以数列，每一横排第一格写血清号码，用0.2 mL吸管将血清以0.08 mL、0.04 mL、0.02 mL、0.01 mL分别依次加于每排4小方格内，吸管须稍倾斜并接触玻璃板，然后以抗原滴管垂直每格血清上滴加一滴抗原(0.03 mL)，或用0.2 mL吸管滴加0.03 mL，用牙签搅拌混匀。一份血清用一个牙签，以0.01、0.02、0.04、0.08的顺序进行。混合完毕将玻板均匀加温约30 ℃左右(无凝集反应箱可使用灯泡或酒精火焰)，5～8 min按下列标准记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。

②记录反应。++++出现大凝集片或小粒状物，液体完全透明，即100%凝集。

　　　　　　+++有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集。

　　　　　　++有可见凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50%凝集。

　　　　　　+仅可以看见颗粒，液体浑浊，即25%凝集。

　　　　　　-液体均匀浑浊，无凝集现象。

③结果判定。同试管凝集反应。结果通知单只在血清凝集价的格内分别换成0.08(1∶25)、0.04(1∶50)、0.02(1∶100)和0.01(1∶200)。

(3)虎红平板凝集试验：

①操作方法。在进行虎红平板试验前，应将抗原和受检血清放置室温30～60 min。准备一块洁净的玻璃板，用蜡笔划成4 cm2的方格，每格中滴一份受检血清0.03 mL。吸取抗原(抗原在吸取前应反复倒转瓶体并摇动，使抗原均匀悬浮)。在每一方格的血清样品旁滴加0.03 mL，每份血清用一根牙签搅动使血清和抗原均匀混合，使抗原和血清摊开呈圆形直径约2～3 cm。在室温(20 ℃)4～10 min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。

②结果判定。在阳性血清及阴性血清试验结果正确的对照下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。

(4)全乳环状反应。用于乳牛及乳山羊布氏杆菌病检疫，以监视无病畜群有无本病感染，也可用于个体动物的辅助诊断方法。可由畜群乳桶中取样，也可由个别动物乳头取样，按《乳牛布氏杆菌病全乳环状反应技术操作规程及判定标准》进行。全乳环状反应抗原用苏木紫染色抗原或四氮唑染色抗原。

被检乳汁须为新鲜全脂乳。凡腐败、变酸和冻结的不适于本试验用(夏季采集的乳汁应于当天内检验，如保存于2 ℃时，7 d内仍可使用)。患乳房炎及其他乳房疾病的乳汁、初乳、脱脂乳及煮沸乳汁也不能作环状反应用。

①操作方法。取新鲜全乳1 mL加入小试管中，加入抗原1滴(约0.05 mL)充分振荡混合;置37～38 ℃水浴中60 min，小心取出试管，勿使振荡，立即进行判定。

②结果判定。判定时不论哪种抗原，均按乳脂的颜色和乳柱的颜色进行判定。

强阳性反应(+++)：乳柱上层的乳脂形成明显红色或蓝色环带，乳柱呈白色，分界清楚。

阳性反应(++)：乳脂层的环带虽呈红色或蓝色，但不如“+++”显著，乳柱微带红色或蓝色。

弱阳性反应(+)：乳脂层环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深。

疑似反应(±)：乳脂层环带不甚明显，并与乳柱分界模糊，乳柱带有红色或蓝色。

阴性反应(-)：乳柱上层无任何变化，乳柱呈均匀浑浊的红色或蓝色。

脂肪较少，或无脂肪的乳汁呈阳性反应时，抗原菌体呈凝集现象下沉管底，判定时以乳柱的反应为标准。

(5)变态反应试验。本试验是用不同类型的抗原进行布氏杆菌病诊断的方法之一。布氏杆菌水解素即变态反应试验的一种抗原，这种抗原专供绵羊和山羊检查布氏杆菌病之用。按《羊布氏杆菌病变态反应技术操作规程及判定标准》进行。

①操作方法。使用细针头，将水解素注射于绵羊或山羊的尾褶壁部或肘关节无毛处的皮内，注射剂量0.2 mL。注射前应将注射部位用酒精棉消毒。如注射正确，在注射部形成绿豆大小的硬包。注射一只后，针头应用酒精棉消毒，然后再注射另一只。

②结果判定。注射后24 h和48 h各观察反应一次(肉眼观察和触诊检查)。若两次观察反应结果不符时，以反应最强的一次作为判定的依据。判定标准是：

强阳性反应(+++)：注射部位有明显不同程度肿胀和发红，不用触诊，一望而知。

阳性反应(++)：肿胀程度虽不如上述现象明显，但也容易看出。

弱阳性反应(+)：肿胀程度也不显著，有时靠触诊始能发现。

疑似反应(±)：肿胀程度似不明显，通常须与另一侧皱褶相比较。

阴性反应(-)：注射部位无任何变化。

阳性反应牲畜，应立即移入阳性畜群进行隔离。可疑牲畜须于注射后30 d进行第2次复检，如仍为疑似反应，则按阳性牲畜处理，如为阴性则视为健康。

自测训练

一、知识训练

1.牛布鲁氏菌病的症状和病变要点。

2.牛布鲁氏菌病的防治要点。

二、技能训练

1.布鲁氏菌病病料的涂片染色镜检。

2.熟练操作平板凝集试验。