从病料中获取细菌纯培养物的技术。病料(尤其是粪便、脓汁、水等)中常包含有一种以上的细菌，可根据检验目的和要求，采集合适的标本，选用相应的培养基和分离培养技术，以获得纯培养物。

培养基 根据细菌生长繁殖的需要，将多种物质按一定比例混合、配制成的一种人工营养制品，供分离培养、鉴定和研究细菌，以及生产抗原和制造疫苗等之用。培养基种类繁多，可从不同角度予以分类。

按用途区分 有5类。①基础培养基：其中含有含氮物质(包括肌酸、尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤及肌肽等)和非含氮物质(包括葡萄糖、磷酸己糖、琥珀酸、无机盐类、硫胺、核黄素、泛酸及尼克酸等)，是细菌生长繁殖所需要的最基本的营养成分。②营养培养基：是在基础培养基中加入血液、血清、鸡蛋、酵母浸液、葡萄糖或甘油等制成，用于营养条件要求较高的细菌，如结核分枝杆菌需要鸡蛋，鼻疽假单胞菌需要甘油等。③鉴别培养基：用于鉴别细菌生化特性，如在蛋白胨水中加入糖类、指示剂及发酵管制成的糖培养基，以鉴定细菌发酵糖类的能力。④选择性培养基：根据细菌对某些物质敏感性的差异，在基础培养基中加入某些物质后，能选择性抑制某一类细菌的生长，而对所要分离的细菌无抑制作用，以达到分离的目的，例如分离沙门氏菌常用的SS琼脂是一种强选择性培养基，其中的胆酸盐能选择性地抑制革兰氏阳性菌，枸橼酸钠及煌绿能选择地抑制大肠杆菌。⑤厌氧培养基：以加液体石蜡或凡士林的庖肉肉汤或肝片肉汤最常用。液体石蜡或凡士林能隔绝外界空气，庖肉或肝片中的非饱和脂肪酸能吸收游离氧， 谷胱甘肽有还原作用， 使培养基内的氧化还原电势下降， 造成厌氧环境， 以利厌氧菌生长。

按组成成分区分 有两类。①非合成培养基： 用天然营养物质， 如蛋白胨、牛肉浸膏、血清等配制而成， 由于对这类营养物的成分不完全了解， 故质量不稳定， 但适于多种细菌生长， 是常用培养基。②合成培养基： 由无机盐或无机盐类加有机物如氨基酸、糖类、嘌呤和嘧啶配制成， 这类培养基的化学成分明确，质量易于控制， 主要用于研究细菌的营养需要代谢活动规律及药物作用机理等。

按物理状态区分 有液体培养基、半固体培养基和固体培养基三类。它们的营养成分可以完全相同，只是在液体培养基中加入不同的凝固剂， 使之不同程度地固化。

分离接种 按所用培养基的物理状态不同， 可采用不同的分离接种方法。①平板划线分离法： 将适当稀释的受检样品在平板培养基上连续划线接种， 使其形成肉眼可见的集落， 这是纯化、分离细菌的重要手段。②平板倾注接种法： 按受检样品中可能含有的菌数， 用稀释液作不同倍数的稀解， 取其一定量， 加入灭菌平皿中， 再倾入熔化并冷却至50℃左右的普通琼脂， 立即摇匀凝固， 置恒温箱中培养后， 查出菌落数， 乘以稀释倍数， 即为受检样品的菌数。③试管斜面接种法： 将受检样品或纯培养物接种于试管斜面培养基或克氏瓶装培养基上， 一般用于菌种保存或制备少量抗原、菌苗。④高层穿刺接种法： 用于试管内固体培养基的接种， 以观察细菌的培养性状、动力， 亦可用于保存菌种。⑤液体培养接种法：用于普通肉汤、蛋白胨水及单糖发酵管等液体培养基的接种， 接种于普通肉汤的细菌经孵育后， 可观察细菌的不同生长性状。糖发酵管培养多用于测定细菌生化特性。

培养 根据细菌对游离氧需要的不同， 培养方法有3种。①大气培养法： 在通常的大气压条件下和普通温箱中，多数需氧菌及兼性厌氧菌都能良好生长，这是一种最常用的培养方法。但当培养某些生长缓慢的细菌如羊布鲁氏菌及牛型结核分枝杆菌等时， 因培养时间长， 恒温箱内应保持一定湿度，以防培养基干燥，影响生长。②二氧化碳培养法： 初代分离培养牛型布鲁氏菌等少数细菌时，需补充5～10%二氧化碳才能生长。最简便的方法是烛缸法， 将接种好的培养基置烛缸中， 点燃蜡烛， 速用缸盖口密封， 便可保持供细菌生长二氧化碳浓度。目前已有专用的二氧化碳培养箱。③厌氧培养法： 除用特制的厌氧肉汤培养外， 也可将接种有细菌的培养皿迅速覆盖在加有碱性焦性没食子酸的玻璃板上， 周围用熔化的石蜡密封， 置于恒温箱中培养。肉毒梭菌等厌氧菌常用此法培养。

培养性状的鉴定 细菌在不同培养基上的生长性状各异， 可作为初步鉴定的依据。①在平板培养基上培养： 主要观察菌落的大小、边缘形状、隆起度、粘稠度、透明度、表面构造及色泽等;在血液琼脂平板上， 观察菌落的溶血性和颜色; 在鉴别培养基上， 应特别注意菌落呈现的颜色。用肉眼或用放大镜或低倍显微镜观察其微细构造。如巴氏杆菌的菌落， 边缘整齐， 表面微隆起、透明、湿润、细小，好似露水珠状;产气荚膜梭菌的菌落， 中央隆起，表面有放射状条纹，边缘呈锯齿状， 炭疽芽胞杆菌的菌落扁平、灰白色、干燥，边缘不整齐如火焰状(图)。②在半固体培养基中培养： 无动力的葡萄球菌等仅沿穿刺线生产; 有动力的大肠埃希氏菌等，则在整个培养基中呈弥散状生长，致使透明的培养基混浊。③在液体培养基中培养： 观察混浊度、沉淀物及沉淀物性状、菌膜或菌环特性。如大肠埃希氏菌在普通肉汤中发育旺盛， 培养物均匀混浊， 有粪臭味; 绿脓杆菌的培养物呈草绿色混浊， 表面形成淡灰色厚菌膜; 炭疽芽胞杆菌的培养基澄清，管底有白色棉絮状沉淀物，摇动试管时呈发辫状升起。

菌落的性状

定量测定 为掌握细菌的生长繁殖规律、代谢强度及外界环境对细菌生长的影响等， 需测定培养物中的细菌数。即计算出一定容积中所含的细菌数。除常用的平板倾注培养法外， 还有平板涂布法、细菌浊度比色法、光电比色法及称重法等。