应用化学或生物学方法对体液和组织中的激素进行定性或定量分析。要充分了解正常生殖机能和内分泌的复杂情况， 它们在体内的代谢、分布和作用机制、动态规律以及诊断与生殖激素有关的繁殖障碍， 必须测定有关各种激素在体液和组织中的含量。测定激素的方法可分为生物测定法、蛋白竞争结合法、放射免疫测定法、放射受体测定法和酶联免疫测定法。这些分析技术不仅为研究激素，而且为许多含量甚微的活性物质在体内的产生、代谢、分布和作用提供了新方法，对进一步认识生命现象(包括繁殖现象)的本质和动态规律作出了贡献，已成为实验研究、诊断疾病不可少的手段。

生物测定法 在动物体内或体外， 根据靶器官或靶细胞的反应测定激素活性和含量的方法。将含有激素的体液 (血浆、血清、尿液、乳汁等)或其浓缩物、组织的匀浆液，注射到某种动物体内，然后测量靶组织的变化反应来测定该激素的含量。20世纪60年代以前，激素含量多用此方法测定。虽然这种方法的精确性受到各方面的限制，但仍然是一种重要的测定方法，并用于验证其他方法的效价。应用生物测定法可测定多种生殖激素。例如，应用未性成熟或摘除垂体的大鼠或小鼠子宫、卵巢的增重反应可测定促卵泡素(FSH)和孕马血清促性腺激素 (PMSG) 含量; 测定促黄体素(LH)时，则依摘除垂体的雄性大鼠前列腺或精囊腺的增长情况定量。将引起上述显著变化的最低有效量定为一个大鼠或一个小鼠单位。抗坏血酸排空试验，在对各种促性腺激素的检查中都广为采用。未成熟或去势大鼠及小鼠子宫的增重反应、阴道涂片检查、雏鸡输卵管增重可用来测定雌激素的含量。根据仔兔子宫内膜碳酸酐酶的含量、子宫内膜增生程度、尿中孕烷二酮含量可测孕酮活性。利用雄雏鸡或去势公鸡的鸡冠增长反应、未成熟或去势大鼠前列腺或精囊腺增重可测定雄激素。上述方法的灵敏度最高可达微克水平。

体外生物测定法是根据体外培养的活细胞对处理的反应测量激素活性。例如，利用抑制体外培养的大鼠垂体前叶细胞分泌促卵泡素的程度， 测量抑制素(in-hibin) 的活性， 灵敏度可达纳克水平。

放射免疫测定法 (radioimmunoassay， RIA) 将同位素的放射测量的敏感性与免疫反应的特异性结合在一起的一种灵敏度高、特异性强的微量分析法。RIA的基本原理是用欲测定的抗原(激素)和同位素标记的同种高纯抗原与欲测物质的标准品为抗原的抗体竞争结合情况来测定。当同位素标记的抗原和抗体浓度固定时，而且前者的浓度大于后者时，竞争结果，游离的同位素标记物及其与抗体结合物的量， 将随欲测物质的含量而变化。在测定中，首先要制备特异性强、亲合力高的抗血清(或单克隆抗体)。测定时，用提纯的激素标准品配制成不同浓度，各取一定含量，加入已知量的标记的激素和特异抗血清。经作用一定时间后，将标记的激素抗体复合物与多余的游离标记激素分离， 测定其放射活性， 根据抗原抗体复合物和游离抗原的比值，制成标准曲线。测定未知样品时，在同样条件下，根据类似的比值， 即可在标准曲线上查出相应的抗原含量。这一方法不仅普遍用于测定许多抗原性蛋白质、酶和多肽类激素， 也广泛用于测定半抗原性的类固醇激素。灵敏度达纳克、皮克水平。自 1959年亚罗(R. S. Yalow)与伯森 (Berson) 合作， 首先成功地应用放射免疫分析法测定了糖尿病人血中胰岛素的浓度以来，随着RIA逐渐标准化和商品化， 已经制成许多商品RIA药盒和高自动化的测试仪器。放射性污染和使用昂贵的仪器是这种方法的缺点。

蛋白竞争结合法 (competitive protein bending as-say， CPBA) 与RIA在原理上基本相同， 即用对某些激素具有较大亲和力的蛋白质代替抗血清。1960年伊金斯(Ekins)利用人血清中甲状腺素结合球蛋白和甲状腺素具有特殊结合的特点首次测定了血清中的甲状腺素含量。用此法已能测定皮质激素、孕酮、睾酮、雌激素等多种类固醇激素和环状核苷。现已被放射免疫测定所取代。

放射受体测定法 (radioreceptor assay ， RRA) 竞争性放射分析法的 一种。其基本原理与RIA类似，只是用受体代替抗血清。制备高浓度、亲和力强和稳定良好的受体是本法的先决条件。LH和HCG受体存在于成年大鼠和猪的睾丸及牛、猪的卵巢黄体中; FSH受体集中在睾丸精细管上皮和卵泡生殖上皮; 孕酮和雌二醇受体分布较广，兔子宫内膜是理想的来源。动物的受体制剂也可用于人的激素测定。一种靶细胞的受体制剂，有可能用于多种激素的放射受体分析。RRA测定的是激素生物活性。RRA是20世纪70年代发展的方法， 分析速度快， 但灵敏度不及RIA的高， 受体不稳定， 易失活。

酶联免疫测定法 (enzyme linked immunosorbentassay， ELISA) 以抗原和特异性抗体的免疫结合反应为基础，以标记在抗原(或抗体)上的酶在一定条件下的酶促反应为测定依据，对样品中的抗原(或抗体)进行定性、定量分析。激素作为一种抗原可用此法检测。具体测定方法很多，现将其中的竞争法简述如下：将含有特异性抗体的免疫球蛋白吸附于两份相同的固相载体上，在载体(1)中加入酶标记的抗原和未知抗原; 在载体(2) 中， 只加入酶标记的抗原，经温育后将游离的抗原洗去， 加入等量的底物与被结合在抗体上抗原所携带的酶发生反应， 促使显色剂生成有色物质，可目测判断“阴性”或“阳性”。用于精确测定时，需制备标准曲线。ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、设备便宜、无放射性污染的优点，已有逐步取代放射免疫测定法的趋势。