★ 细菌的形态鉴定 细菌微小，必须借助于光学显微镜才能看到。细菌从形态上可分为球状、杆状和螺旋状三种基本类型。细菌细胞是由细胞壁、胞浆膜、细胞浆及细胞核等部分构成。有些细菌除具有基本结构外还有荚膜、芽孢、鞭毛和柔毛等特殊结构。细菌的形态、大小及染色特点是鉴定细菌的重要标志。

革兰染色法：取干燥并经火焰固定的涂片滴加草酸铵结晶紫 2～3滴于涂面上，染色1～2分钟后水洗，并将玻片上积水用滤纸吸净。加革兰碘溶液2～3滴于涂片上媒染1～3分钟后，倒去碘液，并用水冲净，再加95%酒精3～5滴于涂面上，脱色30～60秒，水洗，然后加入10倍稀释的石炭酸复红溶液复染1～2分钟，水洗后吸干或烘干，镜检。结果是革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。

姬姆萨染色法：触片经自然干燥后，不用火焰固定，直接滴加姬姆萨染色液数滴(染液中有甲醇，能起固定作用)，经2分钟后再加等量蒸馏水，轻轻摇晃使之与染液混合均匀。5分钟后水洗干燥，或将玻片浸入盛有染色液的缸中，染色数小时或过夜，取出水洗、干燥、滴油镜检。

芽孢染色法：将有芽孢的材料做成涂片，干燥、固定后，滴加5%孔雀绿水溶液于涂片上，加热使其产生水蒸气，以不产生气泡为佳，经30～60秒，水洗30秒，以石炭酸复红，复染30秒，水洗、吹干镜检。菌体呈红色，芽孢呈绿色。

★ 细菌的生化特性鉴定

各种细菌具有各自独立的酶系统，所以在相应的培养基上生长时，可产生不同的代谢产物。据此，可鉴定各种细菌，细菌的生化反应在种、型的鉴别上具有重要意义。进行生化性状检查，必须用纯培养菌进行。生化性状检查的项目很多，应按诊断需要适当选择。现将常用的生化检测方法简介如下。

● 糖(醇、糖苷)类发酵试验

将待检菌的纯培养物接种入各种糖发酵培养基中，置37 ℃环境中培养，培养时间多数为1～2天，长的1周至1个月不等，根据分解速度和试验要求而定。其间要定时观察，如产酸时，指示剂呈酸性反应，则培养液由紫色变为黄色;如不分解糖，则仍呈紫色;如分解后产气，则小管内积有气泡。

● V-P试验

所用培养基为含0.1%葡萄糖的蛋白胨水，pH值7.6。接种菌后于37 ℃恒温箱培养2～3天后取出，按2毫升培养液加V-P试剂0.2毫升，置48～50 ℃水浴2小时或37 ℃水浴4小时，充分振荡，呈红色者为阳性。

● 甲基红(M.R)试验

其培养基和培养方法与V-P试验相同，向培养基内加入数滴甲基红试剂，混匀后判定。培养物中pH值低时呈红色，即为甲基红试验阳性。pH值较高的培养物呈黄色，即为甲基红试验阴性。

● 吲哚试验

将细菌接种于蛋白胨水，37 ℃环境中培养2～3天，沿试管壁滴加试剂(对二甲苯或戊醇)2～3毫升，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2毫升，在戊醇或二甲苯下面的液体变红色为阳性，黄色为阴性。

● 硫化氢产生试验

将细菌穿刺接种于醋酸铅琼脂培养基中，37 ℃环境中培养24小时，穿刺处出现黑色者为阳性，无黑色者为阴性。

● 硝酸盐还原试验

将细菌穿刺接种到硝酸盐培养基内，同时接种已知阳性菌做对照，于37 ℃环境中培养4～5天，加入试剂甲液和乙液各2滴，轻摇培养基，混合均匀。在1～2分钟内若硝酸盐还原变为红色者为阳性，无颜色变化者为阴性。(备注：甲液为氨基苯磺酸，乙液为α-萘胺)。

● 美蓝还原试验(细菌脱氢酶的测定)

于5毫升肉汤培养基中加入1%美蓝液1滴，将被检菌接种于培养基中，在37 ℃环境中培养18～24小时观察结果，完全脱色者为阳性，绿色者为弱阳性，不变色者为阴性。

● 明胶液化试验

取蛋白胨水2毫升，加温至37 ℃，用铂金耳蘸取被检菌液，并在上述蛋白胨水中制成悬液，然后加入一块木炭明胶圆片，放37 ℃水浴中，通常在1小时内看到液化现象，则证明为阳性。

★ 细菌的药敏试验

对分离出的病菌进行药物敏感试验，筛选出高度敏感的药物用于防治该菌引起的感染。方法是将分离的纯培养物涂布普通琼脂或鲜血琼脂平板培养基表面(磺胺类药物的药敏试验要用无蛋白肉汤琼脂平板)，尽可能涂布致密均匀，然后用无菌镊子将已制好的干燥药物纸片(或商品纸片)分别贴于平板培养基表面，一般9厘米直径的平皿可同时贴6～9片。最后将平皿底部向上置于37 ℃温箱内培养18～24小时，取出观察结果。经培养后，凡对该菌有抑制能力的抗菌药物，在纸片四周出现一个无细菌生长的圆圈，称为抑菌圈，按照抑菌圈大小来判定敏感度的高低。抑菌圈直径大于20毫米为极敏感，15～20毫米为高敏，10～15毫米为中敏，小于10毫米为低敏，无抑菌圈为不敏感。

★ 细菌性传染病的实验室诊断程序

下面以禽霍乱为例介绍细菌性传染病的微生物学诊断程序。

● 第一：检验标本的采集

采取心血或实质器官涂片、触片，若实质器官如肝、脾、肾、肺等表面已污染，可浸入95%酒精中立即取出，并引火燃烧，然后用无菌刀片切开，取深层组织接种培养基。除心血可封于毛细管内，其他病料可保存于30%灭菌甘油盐水中。

● 第二：直接涂片、染色、镜检

常同时用两种染色法进行：一是瑞氏染色或姬姆萨染色或美蓝染色;二是革兰染色。如发现典型的两极染色的革兰阴性小杆菌，即可初步诊断为禽巴氏杆菌。

● 第三：分离培养

通常将病料接种于血琼脂平皿，37 ℃环境中培养18～24小时，有巴氏杆菌生长时，出现不溶血、灰白色、露滴状细小菌落，有荧光性，这时可选择典型菌落涂片进行镜检。必要时先以普通肉汤做增菌培养，然后接种于血平板。本菌在麦康凯琼脂上不能生长，可以与沙门杆菌、鼠疫杆菌和伪结核杆菌相区别。必要时还可以做生化试验与其他类似菌相区别。

● 第四：动物试验

巴氏杆菌的动物试验效果较好，故一般在分离培养的同时，做动物试验。动物试验可以检查细菌的毒力，从而判定所分离的巴氏杆菌是否为主要的病原菌。

可用待检病料(1∶10生理盐水悬液)，也可用心血或培养物(接种在含4%血清的普通肉汤培养24小时)。病料中巴氏杆菌毒力较强，而经过培养毒力较弱。实验动物常用小鼠、家兔、鸽子，注射后通常在10～24小时内死亡。选用的实验动物必须是没有带菌的。实验动物死后，取心血及实质器官做涂片和进一步分离培养。采取病料后再进行尸体解剖，接种部位可见皮下组织、肌肉有炎症或水肿，胸腔和心包积有浆液性纤维性渗出物，心外膜有出血点、淋巴结水肿，肝脏不肿大。皮下接种20小时后，实验动物不死亡，也可以从局部抽取渗出液做细菌学检查，以早期诊断。