(一)冷冻精液的保存

1.包装方法

冷冻精液有以下三种包装方法：颗粒法、安瓿法和细管法。目前我国使用较广的是颗粒冷冻精液，细管冷冻精液正在推广使用，并将最终取代颗粒精液。这两种精液都贮存于液氮罐中，保存温度为-196℃。

2.注意事项

为了保证冷冻精液品质，不使精子活力下降，在贮存及取用过程中必须注意以下事项：

(1)保存过程中要定期补充液氮，一般液氮量不足容量的1/3时就应添加，罐内盛装精瓶的提漏不得暴露在液氮面外。

(2)从液氮罐内取出精液颗粒时，提漏不得提出液氮罐口外，可将提漏置于罐颈下部，用长柄镊夹取精液颗粒。

(3)在定期清理液氮罐时，或将贮精瓶向另一超低温容器转移时，动作越快越好，贮精瓶在空气中暴露的时间不得超过3～5秒钟。

(4)保存过程中要尽量减少开盖时间，以减少液氮的消耗。

(二)冷冻精液的解冻和运输

冷冻精液使用前需要解冻，颗粒冻精的解冻多采用2.9%柠檬酸钠溶液。将配制好的2.9%的柠檬酸钠溶液1毫升注入灭菌的试管中，再将试管放于38～40℃的温水中。取1粒冷冻精液投入管中，轻轻摇动即可解冻，然后及时输精(不超过1小时)。细管冻精的解冻，可将其直接投入40℃温水中，见管内精液颜色改变，立即取出，剪去封口的一端，然后直接装在专用的细管金属输精器(卡苏枪)上，即可进行输精。

如果解冻后送异地输精，可用试管分装，用灭菌的玻璃纸棉塞接近液面塞紧，不留空隙，以减少运输时震荡，试管外包上脱脂棉或纱布，再以玻璃纸、无菌塑料袋严密包扎，并做好公牛号的标记。然后再将包装好的试管放入盛有凉水(要求8℃以下)的保温瓶中，盖好瓶塞，在尽可能短的时间内送到输精点，并立即输精。

(三)冷冻精液的质量要求

1.精子活力

指解冻后活力，呈直线前进、运动精子百分率在30%以上，精子复苏率不少于50%。检查方法是：蘸取精液一滴，滴于清洁的载玻片上，盖上玻片，在38℃温度下进行镜检，显微镜以放大到200～400倍为宜。每个滴片观察2～3个视野，并注意观察不同层次的精子运动。

为了准确地评定精子活力，可用血球计算器检查，在计算板上数出非直线前进运动精子数，然后再用3%食盐水杀死全部精子，数出精子总数，二者之差就是活精子数。

2.前进运动精子数

每一颗粒解冻后呈直线前进运动的精子数不少于1200万个，剂量为0.1±0.01毫升。检查方法是：取0.1毫升剂量的冻精颗粒不加解冻液，在载玻片上于室温条件下自然解冻后，用白血球吸管以3%盐水20倍稀释，按下列公式计算：

剂量内前进运动精子数，用总精子数乘解冻后精子活力即得。

3.畸形率

解冻后的精子畸形率不得超过20%。

4.顶体完整率

解冻后的精子顶体完整率不少于20%。

5.菌落数

解冻后的精子无病原微生物，每毫升中细菌菌落数不得超过1000个。

6.存活时间

解冻后的精子存活时间：在5～8℃贮存时间不少于12小时，有效使用时间限度为8小时;在37℃贮存时间不少于4小时，有效使用时间限度为2小时。

牛的冷冻精液必须符合上述指标，否则不得使用。

(四)输精技术

1.输精时机

俗话说：“若叫母牛配得准，发情火候要拿稳。”母牛发情后，什么时间输精最好，这是提高受胎率的关键。

一般母牛排卵时间是在发情结束后的12～15小时，排出的卵子需6～12小时到达受精部位，维持受精能力的时间一般不超过20小时。输精后精子大多数需2～3小时到达受精部位，在母牛生殖道内获能需5～6小时，保持受精能力的时间约为30小时。因此，精子应先于卵子到达受精部位，才能获得最佳受胎率。一般认为，输精时间安排在排卵前6～18小时，受胎率高。但母牛排卵时间不易掌握，在生产中可综合分析判定。

(1)根据母牛是否出现“静立不动”的发情表现进行输精：如果计划输精两次，可在母牛表现出“静立不动、接受爬跨”时进行第一次，间隔8～12小时后进行第二次。也可采用早上爬稳，下午输精，第二天上午视情况再复配一次;下午爬稳，次日早上输精，下午视情况再复配一次。若只计划进行一次输精，可在“静立不动”后8～12小时进行。

(2)看阴道变化而确定：由阴道流出的粘液粘稠、黄色、块状，子宫颈口稍紧而硬、输精器容易插入时开始输精，过8～12小时进行第二次输精。

(3)由直肠触摸检查卵巢情况而定：直肠触摸卵巢时，卵泡壁变薄，卵泡液波动明显，有一触即破之感，即可输精，过8～12小时再次输精。

2.输精前的准备

(1)器具消毒：玻璃或金属输精器、小试管等要用2%碱水洗涤，再用清水冲洗干净，放入白布袋内经蒸汽消毒30分钟，保存待用。也可用70%酒精棉球擦拭消毒，用酒精火焰烘干输精器外壁。用消毒过的输精器吸取精液之前，应当用加温的2.9%柠檬酸钠溶液冲洗输精管，然后再吸取精液。

(2)将待输精的母牛牵入配种架内进行保定之后，用清水洗净其外阴部，用2%来苏儿或0.1%高锰酸钾溶液消毒，并擦干。

(3)输精员穿上胶皮围裙和胶鞋，戴上长臂乳胶手套，其外面淋水，并涂擦肥皂。

3.输精时操作要点

采用直握法进行。将手插入母牛直肠，把子宫颈后端轻轻固定在手中，手臂往下按压使阴门开张，另一手把握装好精液的输精器，自阴门向斜上方徐徐插入5～10厘米，以避开尿道口，再平插或稍向斜下方插入阴道前方，将输精器徐徐越过子宫颈口内的皱褶，缓慢旋转送至子宫颈深部(送至子宫体或卵巢发育侧的子宫角)，缓慢注入精液。待拉出输精器后，再将直肠内的手退出。

4.输精注意事项

(1)处理精液的过程中，如吸取精液或注入精液时，动作要慢，以减少对精子的机械性刺激。

(2)输精时，精液的温度应保持在28～36℃之间，接触精液的输精器应与精液的温度相等或接近。

(3)在输精操作过程中，如母牛弓腰强烈努责时，应暂停操作，绝不能强行输精。可让助手掐捏母牛腰椎，缓和腰部紧张。

(4)输精器插入子宫颈时，动作要小心，慢慢旋转前进，遇到阻力时，不能强行插入。

(5)输精过程中，输精员应随牛的左右摆动而摆动，以免输精器折断。

(6)输精完毕，手不能松开后端活塞或小橡皮球，待输精器撤出后才能松手，防止精液回吸到输精器内。

(7)发现大量精液倒流，应重新输精。