一、训练目的

了解和掌握猪瘟的现场诊断和实验室诊断方法。

二、训练用设备和材料

载玻片、剪刀、镊子、手术刀、酒精灯、显微镜、荧光显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、铝锅、肉汤培养基、琼脂平板、血液琼脂平板、猪瘟兔化弱毒苗、冰冻切片机、荧光抗体、研钵、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线灯、被检材料、工作衣帽、靴等。

三、训练内容及方法

(一)猪瘟的生前检查

1.流行病学

应了解病畜所在地区以往有无猪瘟的发生、流行形式、发病季节、发病的动物种类、发病和死亡情况、采取哪些相应的措施、对尸体如何处理以及近年来猪瘟预防接种工作等情况。

2.临床检查

详细检查病猪的临床症状，包括步态及精神状态，大便形状和质地及是否带血或黏液，眼结膜和口腔黏膜是否有出血变化，体表可触摸淋巴结(鼠蹊淋巴结)肿大情况，体温变化情况等。

(二)猪瘟的实验室诊断

1.病理剖检

病猪急宰或死亡后，应进行剖检，全面检查各系统内脏器官的眼观病理变化，特别注意淋巴结、咽喉、肾脏、膀胱、胆囊、心内外膜、肠道等脏器的出血性变化。

2.细菌学检验

采取刚死不久的病猪或急宰猪的血液、淋巴结、脾脏等材料，接种于血液琼脂和麦康凯琼脂平板上，培养24～48 h，检查有无疑似的病原细菌。猪瘟诊断中细菌学检查的目的是为了确定发病猪(群)是否存在并发或继发细菌感染。

3.兔体交互免疫试验

(1)选择体重1.5 kg以上大小基本相等的清洁级健康家兔4只，分为2组;试验前3 d测温，每天3次，间隔8 h，体温应正常。

(2)采病猪淋巴结和脾脏等病料做成1∶10悬液，取上清液按每毫升加青霉素、链霉素各1 000 IU处理后，以每只5 mL的剂量肌肉内接种试验兔。如用血液需加抗凝剂，每头接种2 mL。对照组不接种。

(3)继续测温，每隔6 h 1次，连续3 d。

(4)7 d后用猪瘟兔化弱毒疫苗(1∶20～1∶50稀释)静脉注射试验兔和对照兔，每只1 mL。每6 h测温1次，连续3 d。

(5)如果试验组兔体温正常，而对照组兔出现定型热反应，则诊断为猪瘟;如果试验组兔与对照组兔都出现定型热反应，则不是猪瘟。

4.直接荧光抗体检查

(1)取高温期病猪的扁桃体、淋巴结、脾或其他组织一小片，制成压印片或冰冻切片，置室温干燥。

(2)滴加冷丙酮数滴，置-20 ℃固定15～20 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，阴干。

(3)滴加猪瘟标记荧光抗体，置37 ℃饱和湿度箱盒内作用30 min，取出，倒掉荧光抗体。

(4)用pH 7.2的PBS漂洗3次，每次5～10 min。

(5)干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。

(6)如果被检组织细胞胞浆内有弥漫性、絮状或点状的亮的黄绿色荧光，为猪瘟;如仅见暗绿或灰蓝色，则不是猪瘟。

(7)试验设已知含猪瘟病毒材料压印片和不含猪瘟病毒材料压印片作对照。

(8)标本染色和漂洗后，浸泡于5%吐温80-PBS(pH7.2，0.01 mol/L)中1 h以上，除去非特异染色，晾干后用0.1%伊红美蓝复染15～30 min，检查判定同上。

5.猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

常规RT-PCR方法：以提取的RNA为模板，在反转录酶和引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在Taq DNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的基因拷贝数放大1倍。经过35次循环，最终使基因放大数百万倍。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见DNA片段的扩增带。

检测引物为：上游引物P1：5′-gct　cct　ggt　tgg　taa　cct　cgg-3′;下游引物P2：5′-tga　tgc　tgt　cac　aca　ggt　gaa-3′。扩增片段大小为507 bp。

常规RT-PCR操作步骤如下：

(1)样品处理。样品经组织研磨器充分研磨后，以1∶10的比例加入灭菌的PBS液或生理盐水，充分混匀后，于-20 ℃冻融2次，6 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

(2)RNA提取。取100 μL上清液放入1.5 mL离心管中，加500 μL Trizol，上下颠倒5次，混匀，室温放置15 min。加入100 μL氯仿，用漩涡器混匀，室温放置8 min，期间混匀2次。12 000 r/min离心15 min。取上清液200 μL加200 μL异丙醇混匀，-20 ℃放置过夜。12 000 r/min离心15 min，缓慢倒掉上清液，倒扣于吸水纸上，沿管壁缓慢加入75%无水乙醇0.5 mL，10 000 r/min离心10 min，缓慢倒掉75%无水乙醇，倒扣于吸水纸上。置超净工作台吹干。加入20 μL DEPC处理的无菌双蒸水溶解核酸，备用(或-20 ℃保存)。

(3)反转录(RT)反应。在干净的1.5 mL EP管中依次加入：5 μL RNA(模板)、4 μL 5×Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP、1 μL 10 pmol/L混合引物(P1+P2)、1 μL RNA酶抑制剂、1 μL MLV逆转录酶、6 μL双蒸水。混匀后置38 ℃反应60 min，产物即为反转录产物。

(4)PCR反应。在0.5 mL管中依次加入：3 μL 10×PCR Buffer、2 μL 25 mmol/L MgCl2、3 μL 2.5 mmol/L dNTP、1 μL 10 pmol/L混合引物、5 μL反转录产物、0.5 μL 5U/Taq DNA聚合酶、双蒸水15.5 μL，总体积30 μL。混匀，置于PCR仪自动循环。将反应管插入扩增仪中，指令设定程序开始工作。预变性94 ℃ 3 min，35个循环包括：变性94 ℃ 40 s，退火50 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，最后一次延伸为5 min。

(5)加样。取10μL PCR扩增产物和1～2 μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照DNA的PCR扩增产物作为对照，同时取6 μL DL-2 000 Marker加入1孔内作标准对照。

(6)电泳。电压100～120 V电泳30～60 min。

(7)结果观察和判定。电泳结束后，取出凝胶板置于凝胶成像分析系统进行观察。如果被检样品扩增产物的DNA带与阳性对照带在一条直线上，扩增片段为507 bp，即扩增产物条带的大小与阳性对照条带的大小相同，则该样品判定为阳性，反之为阴性。

自测训练

一、知识训练

1.猪瘟的流行特点、临床和病变特征。

2.猪瘟病的综合防治措施。

二、技能训练

初步学会猪瘟部分实验室诊断方法。