一、训练目的

掌握鸡新城疫病临诊诊断要点及实验室诊断技术。

二、训练用设备和材料

恒温培养箱、离心机、刻度离心管、接种环、微量移液器、96孔V血凝板、微型振荡器、注射器(1 mL、5 mL、20 mL)、组织研磨器、试管、吸管、疑似ND病鸡、9～11日龄SPF或非免疫鸡胚、pH7.2磷酸缓冲盐水(PBS)、1%红细胞悬液。

三、训练内容及方法

(一)新城疫病临诊诊断要点

本病主要侵害鸡，其次是火鸡、珍珠鸡和野鸡，鸭、鹅等水禽很少感染发病。典型新城疫高热，精神委顿、嗜睡;嗉囊积液，倒提病鸡时常从口角流出大量酸臭的液体，排黄绿色或黄白色水样稀便;病鸡咳嗽，呼吸困难;部分病鸡还出现翅和腿麻痹、站立不稳等症状;病鸡用抗生素或磺胺类药物治疗无效。特征性的病理变化是腺胃黏膜和乳头肿胀、出血或溃疡;在腺胃与食道或腺胃与肌胃的交界处常有条状或不规则的出血斑，肌胃角质层下有出血或溃疡、坏死。从十二指肠到盲肠和直肠可能发生从充血到出血的各种变化。肠黏膜上有纤维素性坏死性病灶，有的形成假膜，假膜脱落后形成“枣核状”溃疡。盲肠和直肠黏膜的皱褶常呈条状出血。盲肠扁桃体肿大、出血和坏死。

(二)实验室诊断

1.新城疫病原分离与鉴定

(1)病料的采集及处理。分离病毒的病料应采自早期病例。无菌操作取疑似新城疫病死鸡的脑(易磨碎，含毒量高，不易污染)、脾脏、肝脏或骨髓(含毒时间最长)，生前可采取呼吸道分泌物。按1∶5加入灭菌的生理盐水，置组织匀浆器或研钵研磨(脑组织可用玻璃棒在试管内搅拌)，取上清液加青霉素和链霉素各1 000 IU/mL，后置于冰箱中作用2～4 h，然后离心沉淀，取上清液作为接种材料。如果是气管或粪便由于污染重可再加庆大霉素500 IU/mL，以2 000 r/min离心15 min或过夜，备用。在接种前，应对接种材料进行无菌检查。取接种材料少许接种于血琼脂斜面及厌氧肉肝汤各1管，置于37 ℃培养观察2～5 d，应无菌生长。若有细菌生长，应将原始材料再作除菌处理，也可改用细菌滤器过滤除菌。

(2)鸡胚接种。用无菌卡介苗注射器抽取上清液按每枚0.2 mL，经尿囊腔接种至少5枚9～11日龄的SPF鸡胚(或非免疫鸡胚)，接种后用熔化的石蜡将卵壳上的接种孔封闭，35～37 ℃孵育4～7 d。18 h后每8 h观察鸡胚死亡情况。

(3)病毒收获。将18 h以后死亡的和濒死的以及结束孵化时存活的鸡胚置4 ℃冰箱4～24 h，无菌采取尿囊液。

(4)病毒鉴定。采取血凝试验对样品进行血清学检测。对于血凝试验呈阳性的样品采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离的尿囊液继续传代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。

2.血凝试验及血凝抑制试验(抗体检测)

NDV能凝集鸡的红血球，故可以利用这种特性来推测材料(上述的鸡胚尿囊液)中有无该病毒的存在。如有能凝集鸡红血球的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性，故病毒的血球凝集抑制试验，可用已知病毒来检查相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。

该试验有全量法和微量法两种，现多采用微量法。

(1)微量血凝(HA)试验：

①取96孔V型微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔滴加0.025 mLPBS，换滴头。

②吸取0.025 mL病毒悬液(如尿囊液)加于第1孔中，充分混匀，然后从第1孔中吸取0.025 mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔中吸取0.025 mL弃之，设第12孔为阴性对照，换滴头。

③每孔再加0.025 mLPBS。

④最后在每孔中加入0.025 mL 1%(V∕V)的鸡红细胞悬液(红细胞悬液充分摇匀后加入)。

⑤振荡混匀，室温20～25 ℃下静置40 min后观察结果，或4 ℃下静置60 min(若周围环境温度太高)。

⑥判定HA结果时，将反应板倾斜，当对照孔的红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底才能进行结果判定，在对照孔出现正确结果的情况下，以完全凝集(板倾斜时红细胞无泪滴状流淌)的病毒最高稀释倍数为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。

如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离的尿囊液继续传1代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。对于血凝试验呈阳性的样品，说明上述的鸡胚尿囊液中存在能够凝集鸡红细胞的病毒(如NDV、AIV或腺病毒等)，但要确定是否是NDV，还须采用新城疫标准阳性血清进一步进行微量血凝抑制试验，才能进行判断。

(2)微量血凝抑制(HI)试验：

①根据血凝试验结果配制4HAU，即以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除于4即为含4单位病毒(4HAU)的抗原的稀释倍数，4 ℃保存，当天使用有效。

②取96孔V型微量反应板，用微量移液器在1～11孔各加入0.025 mLPBS，第12孔加入0.05 mLPBS，换滴头。

③在第1孔加入0.025 mL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025 mL至第2孔，依此类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去0.025 mL，第11孔为阳性对照，第12孔为PBS对照。

④在第1～11孔各加入0.025 mL含4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温下(约20～25 ℃)静置不少于30 min，4 ℃不少于60 min。

⑤每孔加入0.025 mL1%的鸡红细胞，混匀后，室温(约20～25 ℃)静置约40 min，若周围环境温度太高时，放4 ℃静置60 min，当对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。

⑥判定结果：只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2 log 2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效;尿囊液HA效价大于等于4 log 2，且标准新城疫阳性血清对其HI效价大于等于4 log 2，判为新城疫病毒;对确定存在新城疫病毒繁殖的尿囊液应进一步测定其毒力。

不同的新城疫分离株的毒力差异显著，而且由于ND弱毒活疫苗在家禽中的广泛使用，仅从发病鸡群分离出NDV还不能作出ND的确诊。因此，需对分离毒株的致病性进行评估，可进行1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)、鸡胚平均致死时间(MDT)以及最小致死量等指标的测定，然后根据结果加以判断。

自测训练

一、知识训练

1.鸡新城疫的流行病学、临诊症状和病理变化有哪些特点?

2.拟订新城疫病的综合防治措施。

二、技能训练

1.记录ND实验室诊断的内容及结果，并进行判定。

2.学会新城疫抗体的检测(血凝抑制试验)方法。