一、训练目标

初步学会口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验、反向间接红细胞凝集试验以及乳鼠中和试验等诊断技术。

二、训练用设备和材料

平皿、吸管、金属打孔器(外径4 mm)、模板、VIA抗原、口蹄疫(A、O、C和Asia1型)鼠化毒及标准阳性血清、微量注射器、盐水、接头及乳胶头若干、Tris-HCl缓冲液(Tris 2.42 g，氯化钠3.8 g，叠氮化钠0.2 g，无离子水加至100 mL，用盐酸调pH至7.6)、离心机、试管、乳鼠、1 mL注射器及针头、酒精灯、剪刀、镊子、橡胶手套、工作衣帽等。

三、训练内容及方法

(一)口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验

本方法用于检测被检动物血清中是否含有口蹄疫病毒感染相关(VIA)抗体(口蹄疫多型抗体)，以证实被检动物是否感染过口蹄疫病毒。本试验适用于易感动物的检疫、疫情监测和流行病学调查。操作方法如下：

(1)血清处理。被检血清和阳性血清均以56 ℃灭能30 min。

(2)琼脂糖平板的制备。取琼脂糖1 g，Tris-HCl缓冲液100 mL，装入三角瓶中，于沸水中加热或高压，将琼脂糖彻底融化。然后吸取7 mL琼脂液加到平皿里，制成3 mm厚的琼脂板。待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，贮藏在4 ℃冰箱中备用。

图3-1　1、4孔加入FMD阳性血清;2、3、5、6孔加入被检血清

(3)打孔。将模板放在琼脂板上，用打孔器垂直通过模板的孔在琼脂板上打孔，并挑出孔中的琼脂块，并将平皿底部在酒精灯上略烤封底。

(4)加样。按图3-1方式用微量移液器每孔加样20 μL，即中心孔加VIA抗原，1和4孔加FMD阳性高免兔血清，2、3、5、6孔加被检血清。

(5)扩散。将加样的琼脂平皿置于湿盒里，于室温(20～22 ℃)下任其自然扩散。

(6)观察。于24 h进行第1次观察，72 h作第2次观察，168 h作最后观察。观察时，可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须借助于强光源才能看清沉淀线。

(7)结果判定。当1和4孔标准阳性血清与抗原中心孔之间形成沉淀线时，被检血清孔与中心孔之间也出现沉淀线，并与阳性沉淀线末端相融合，则该被检血清判为阳性。被检血清孔与中心孔之间虽不出现沉淀线，但阳性沉淀线的末端向内弯向被检血清孔，则该被检血清判为弱阳性。如被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且阳性沉淀线直向被检血清孔，则该被检血清判为阴性。

(二)反向间接红细胞凝集试验

1.病料处理

(1)用pH 7.2的0.01 mol/L磷酸缓冲液(或生理盐水)洗2～3次，并用消毒滤纸吸去水分。

(2)称重，加少许玻璃砂研磨，制成1∶3悬液，室温浸毒1 h或4 ℃冰箱中过夜。

(3)3 000～4 000 r/min，离心20 min，收集上清液。

(4)58 ℃水浴箱灭能40 min(或不灭能)。

(5)3 000～4 000 r/min，离心20 min，收集上清液即为被检抗原，置4 ℃冰箱中备用。

2.被检抗原的稀释

试管架上摆上一排试管8支，自第1管开始由左至右用稀释液进行倍比稀释(即1∶6，1∶12，1∶24，…，1∶768)，每管体积0.5 mL。

3.滴加被检抗原

取有机玻璃反应板，在第1至第4排每排的第8孔滴加第8管稀释抗原2滴，每排的第7孔滴加第7管稀释抗原2滴，以此类推至第1孔，每排的第9孔滴加稀释液2滴，作为阴性对照，每排的第10孔按顺序分别滴加A、O、C、Asia1四种标准抗原(1∶30稀释)各2滴，作为阳性对照(注意每型换滴管1支)。

4.滴加红细胞诊断液

用前将红细胞诊断液摇匀，于反应板第1至第4排孔分别滴加A、O、C、Asia1型红细胞诊断液1滴。轻轻振摇反应板，使红细胞均匀分布。室温放置1.5～2 h后判定结果。

5.结果判定

(1)判定标准。按以下标准判定红细胞凝集程度：

++++　——完全凝集;+++　——75%凝集;++　——50%凝集;+　——25%凝集;-　——不凝集。

(2)观察反应板上各排孔的凝集图形。假如只1排孔凝集，且阴性对照孔不凝集(阴性)，阳性对照孔凝集(阳性)，其余3排孔不凝集，则证明此种凝集是与A型红细胞诊断液同型病毒所致的特异性凝集，被检抗原即判为A型;若只第二排孔凝集，其余3排孔不凝集，则被检抗原判为O型。以此类推。

(3)致敏红细胞凝集(凝集图形为++以上者)的抗原最高稀释度为其凝集效价。

(4)某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数(以2为底)滴度以上者为阳性。

(三)乳鼠中和试验

1.试验材料

(1)送检血清。在牛、猪、羊患口蹄疫后，不早于10 d和不晚于60 d采血分离血清(恢复血清)作为送检血清。将分离出的血清3～5 mL倾入消毒的青霉素瓶中，在冷藏的条件下送检。在送检血清的说明书上，应注明采血牲畜的种类、年龄、患病时期、采血日期和保存方法。

(2)选用营养良好，并有母鼠喂奶的5～7日龄的小白鼠(每份被检血清用12只)。为了避免喂奶母鼠吃掉注射后的小鼠，可在注射前取出母鼠置于另一容器中，再一一取出乳鼠注射，然后放回容器内，待全部注射完毕后再放回母鼠。在注射时须用镊子夹着小鼠的背部皮肤提起，不要用手接触，以免吃奶小鼠体表因污染人体的气味而被母鼠吃掉。如果用手碰摸了吃奶小鼠，则于注射后在它的体表擦少许乙醚除去气味。

(3)将标准O、A、C及Asia1型鼠化毒分别磨碎，用生理盐水稀释(约为1∶100至1∶1 000)，使用方法可根据瓶签上的规定。

2.试验方法

将受检血清用生理盐水稀释，每1 mL血清加2 mL生理盐水稀释后在每只乳鼠的颈部皮下注射0.2 mL。注射后经24 h将小鼠分为4组，每组3只，各组涂以不同颜色。第1组每只于颈部皮下注射标准O型鼠化毒0.2 mL，第2组注射A型鼠化毒，第3组注射C型鼠化毒，第4组注射Asia1型鼠化毒。注射后放回原处与母鼠同养。

同时每组设对照乳鼠2只，不注射血清，只分别注射各型鼠毒(用量与试验组相同)，以检查每一型鼠化毒的致病力。4组共用8只小鼠。对照组涂以与试验组相同的颜色，然后放回母鼠处，但需与试验组分别饲养。

注射后所有乳鼠的观察期为3～4 d，根据试验组与对照组的乳鼠发病死亡情况，统计其结果，进行判定。乳鼠的典型症状是：呼吸急迫，前后肢麻痹，然后延至全身，多在感染后18～30 h出现病状，最后死亡。

根据送检血清对某一标准毒型(O，A，C，Asia1)病毒的保护作用，来决定送检地区所流行口蹄疫的病毒型。假设被检血清能保护注射Asia1型病毒的小鼠，但不能保护注射其他型(O、A、C)病毒的小鼠，即可判定送检的口蹄疫血清属于Asia1型，其余类推。

在送检过程中，应该注意防止散毒。试验结束后，应将病鼠及死鼠烧毁，鼠笼或缸用3%NaOH消毒，器械用煮沸法消毒。

本法可用以鉴定口蹄疫病毒的主型。

自测训练

一、知识训练

1.猪口蹄疫是如何传播的?

2.猪口蹄疫的防治措施。

二、技能训练

初步学会口蹄疫的实验室诊断操作方法。