★ 病毒的形态观察 病毒不具备细胞结构，只能在活组织细胞内生长繁殖，其形态甚为微小，但均有各自的外形和结构。病毒的形态观察常借助电子显微镜，在电子显微镜下，病毒的形态有圆形、丝状和弹状等。各种病毒的大小和形态结构是鉴定病毒的初步依据之一。

★ 病毒的分离培养

病毒无独立的酶系统，不能在无生命的培养基上生长，常用的分离培养方法有实验动物、鸡胚和组织细胞培养三种。当今细胞培养成为常用的病毒培养检查手段，以往常用的鸡胚和实验动物法已大为减少。

● 组织细胞培养

组织细胞培养最初是动物和植物组织的体外培养，随着现代人工培养技术的发展，组织细胞培养的确切说法应包括组织培养、器官培养和细胞培养，应用最广的为细胞培养。现在禽病的病毒诊断研究中，鸡胚成纤维细胞应用较为广泛，以此为例(省略器材的准备和各种溶液的配制)简略说明培养方法。

◆第一步，鸡胚成纤维细胞(CEF)培养

鸡胚的处理：选用10～13日龄的鸡胚，在气室部用5%碘酊消毒，以无菌操作的要求用镊子敲破气室部的蛋壳，撕破壳膜、绒毛膜及羊膜，用眼科镊子钩住鸡胚头部，取出鸡胚置于灭菌平皿内，剪去喙、翅、脚、眼球及内脏，用Hank’s液洗净外表血液，移至小烧杯内，将鸡胚剪成1～2毫米的细块，加适量Hank’s液轻轻摇动，静置使组织块下沉，吸去混有红细胞及碎片的悬液，如此洗涤2～3次，直至上清液不再混浊为止。

消化：将0.25%胰蛋白用NaHCO3调至pH值7.6～7.8，然后加入鸡胚碎块(鸡胚和胰酶用量比为1∶4左右)置37 ℃水浴锅内加温，每5分钟摇动1次，直至组织块不易下沉具有黏稠现象为止，一般约20分钟。消化后取出静置1～2分钟，吸去胰酶液，加入Hank’s液轻摇，用精径吸管吹吸6～7次，使细胞分散，静置1～2分钟，待组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出置另一瓶内，如此反复数次，使细胞尽量从组织块上脱落下来。将各次所得的细胞悬液合并在一起。

细胞计数：将细胞悬液摇匀，吸出少量滴入红细胞计数板上，按白细胞计数法，计算四角大方格内完整细胞的总数，换算成每毫升的细胞数。

分装：根据细胞总数，用营养液配成50万～70万个/毫升细胞的悬液，装入培养瓶内。青霉素小瓶，每瓶1毫升，小方瓶每瓶5毫升，瓶口用橡皮塞塞紧，不得漏气。将培养瓶置于培养盘中，勿使营养液触及瓶塞，置37 ℃环境中培养24～48小时，可长成单层细胞。

◆第二步，病毒的接种与鉴定

接种病毒：长成的单层细胞即可接种病毒，待检病料预先应做无菌处理，接种时先倾去原来的培养液，加入待检病料，病料以原液和10倍稀释，每个稀释度接种2～3个细胞培养瓶，接种量以能盖住细胞层为度。置37 ℃环境中培养30分钟，使病毒充分吸附于细胞表面。取出后倒去病毒液，然后加上和原来液体相同量的维持液，置培养箱内培养，每日观察细胞病变。

鉴定病毒：判定病毒是否增殖的方法有：观察细胞病变、电子显微镜观察、红细胞吸附、病毒间的干扰现象及抗原性测定。

细胞病变(CPE)：是病毒增殖常用的识别指征，不同的病毒产生CPE所需时间不同，快者接种后24～48小时开始出现CPE，慢者需数周后才出现CPE，有的病毒产生CPE不明显，甚至不出现CPE。

电子显微镜观察：是一种快速有效的方法，在电镜下可看到病毒粒子，且可根据病毒形态，初步确定为哪一种病毒科(属)。

红细胞吸附：感染正、副病毒及被盖病毒的细胞，具有吸附红细胞的特性。当空白对照细胞不吸附红细胞，而接种病毒吸附红细胞时，说明有病毒增殖。

病毒间的干扰现象：一种病毒在一种细胞中增殖后，常能抑制随后另一种病毒的增殖，称为干扰现象。这种方法可用于识别不产生CPE的隐性病毒感染。

抗原性测定：在培养细胞中如有病毒增殖，其培养物中含有特异性的病毒抗原，应用相应血清学方法可检测到这些抗原，以此既可判定有无病毒增殖，又可识别病毒种类。

★ 病毒的血清学检验

血清学诊断是建立在抗原与相应抗体发生可见反应这一原理的基础上，有的反应是不可见状态，可应用补体、溶血以及荧光素、酶和同位素标记等指示系统，使其成为可见或可测状态。血清学方法具有严格的特异性和较高的敏感性，在传染病的诊断、病原微生物的分类和鉴定以及抗原分析等方面，均具有广泛的应用。用已知的抗体，可以对分离获得的病原微生物予以鉴定。相反，通过已知的抗原可对康复家禽、隐性感染家禽以及接种疫苗后的家禽抗体加以定性或定量测定。血清学检查方法有很多，本书仅对禽病诊断中常用方法做较为详细的介绍，其余概要论述。

● 玻片凝集反应

玻片凝集反应又称快速凝集反应，为一种定性试验。在鸡白痢的诊断及流行病学调查中较为常用，现以鸡白痢玻片凝集试验说明其操作方法。

先用滴管吸取诊断液(即鸡白痢凝集抗原)1滴(约0.05毫升)滴在洁净的玻片或普通厚玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉采血1滴(约0.04毫升)使二液均匀混合，可用牙签搅拌均匀，或微微摇动玻板，时时变动玻板水平位置，使抗原与血液充分混合。阳性反应，在1～3分钟内细菌和红细胞从混合液滴的边缘开始逐渐凝集成较大的颗粒或呈片状、团块状，将红细胞凝集成许多小区，余下透明的液体，外观呈花斑状。如果在2～3分钟内不出现凝集现象，则为阴性反应，此时可见玻板上的混合液保持原来的状态，或是中间部分较浓，四周为较稀薄的混悬物。

● 血凝与血凝抑制试验

有许多病毒能够凝集某些动物和人的红细胞，而这种血凝作用可被特异性抗体所抑制。借此，可应用标准病毒悬液测定血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的病毒。血凝与血凝抑制试验是诊断鸡新城疫的重要手段，现以此为例介绍血凝与血凝抑制试验的基本方法。

微量血凝试验：采用96孔V形微量板。待测抗原自1∶10开始倍比稀释，每孔加入抗原0.05毫升，最后一孔不加抗原作对照。再吸入0.5%红细胞悬液依次加入各孔，每孔0.05毫升，置微型混合器上振荡1分钟或用手轻轻振荡血凝板，使细胞和抗原充分混合。然后置室温(18～20 ℃)下30～40分钟，根据细胞沉降图形判定结果，以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原血凝滴度。

出现血凝的微量板孔红细胞会均匀分布于孔底周围，完全不出现血凝的红细胞会全都集中于微量板孔的最低点，不完全凝集的形态介于两者之间。此法主要用于检测抗原的效价。

微量血凝抑制试验：采用固定抗原稀释法(即β法)。抗原用4个血凝单位的血凝价或按抗原说明书的要求将血凝价稀释至一定浓度。血清直接在抗原中做倍比稀释。操作时先取4单位抗原依次加入2～11孔，最后孔滴加生理盐水，第一孔加抗原为8单位血凝价，然后用稀释器吸取待检血清0.05毫升于最后孔中(血清对照)，混合后吸取0.05毫升于第一孔，弃去0.05毫升，依次倍比稀释，则各孔均为4单位，置室温(18～20 ℃)下作用20分钟，再用稀释器滴加0.5%红细胞悬液于各孔中，振荡混合后静置30～40分钟，判断结果。以完全抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制(HI)滴度。通常以2为底的负对数(-log2)表示，其HI滴度恰与板上出现完全抑制的最高孔数一致。如第6孔完全抑制，则其HI价为6，此即为血清的HI价。

HI试验测定新城疫卵黄抗体：方法同β-微量法。先在蛋壳上打一蚕豆大的孔，放尽蛋清，用1毫升注射器插入卵黄中，吸取0.5毫升卵黄液于等量8%枸橼酸钠溶液中，混合后即可按照β-微量法测定HI滴度。