猪蓝耳病亦称猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖障碍和呼吸道传染病，临床主要表现为妊娠母猪繁殖障碍，妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎;仔猪主要表现为间质性肺炎等症状。本病于20世纪80年代在美国首次流行以来，迅速传遍世界主要养猪国家，中国于1995年发现该病，是威胁我国当前养猪业持续健康发展的主要疫病之一，加强该病的分析研究和综合防控，对生猪生产稳定发展意义重大。2016年12月，四川眉山某猪场暴发疑似猪繁殖与呼吸综合征疫情，发病猪呼吸困难，剖检肺部病变明显，送至四川农业大学动物生物技术中心进行实验室检测。
1材料与方法
1.1 临床样品采集
2016年12月，四川眉山某猪场发生疑似PRRS，主要表现为仔猪食欲减退、高热，体温41 ℃，轻微腹泻以及严重的呼吸道症状，剖检可见肺部间质性肺炎，全身淋巴结轻度水肿。通过临床特征和病理解剖初步判断为PRRS。采集发病猪血清以及肺脏、淋巴结和脾脏等组织冷藏保存，送实验室进行PRRSV的RT-PCR诊断。
1.2 主要仪器和材料
Mastercycler PCR 扩增仪(Eppendorf，德国)、Gel Doc 2000 凝胶图像分析系统(BIO-RAD，美国)、2×Taq Plus PCR MasterMix(含染料)购自天根生化科技(北京)有限公司，反转录试剂盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker(宝生物工程大连有限公司)。
1.3 引物设计与合成
本实验所使用引物如表1所示，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 病料处理及RNA的抽提
取采集病料0.5～2.0 g 研磨，并按1∶3 比例加入生理盐水配成病料悬液，随后反复冻融3次。冻融后按12 000 r/min 离心5 min 后取上清液，按照Trizol法提取RNA，并将提取的RNA按照反转录试剂盒方法制成cDNA保存备用。
1.5 RT-PCR检测
取1μL cDNA于PCR管中，然后分别加入引物P1、P2和P3各10 pmol，2×PCR Master Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，混匀后置PCR仪中按照以下程序进行扩增：95 ℃，1min;95℃,5s,57℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40个循环;72 ℃ 1 min; PCR结束后取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
1.6 Nsp2和ORF5基因扩增
以1.5反转录的cDNA为模板，分别加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物，2×PCR Master Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，扩增Nsp2高变区和ORF5基因。
1.7 克隆与鉴定
PCR扩增结束后用1%琼脂糖凝胶电泳、电压100 V、30～50 min后观察结果，按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段，与pMD19-T Simple Vector载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取白色菌落，接种于LB液体培养基(Amp+)中培养后提取质粒，经NcoI、BamH I双酶切及PCR鉴定，阳性菌液保存备用。
1.8 序列测定及分析
将含目的DNA的阳性菌液送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。采用DNAStar软件(Version 7.0)对Nsp2基因、ORF5基因序列与GenBank中收录的PRRSV的Nsp2基因、ORF5 基因序列的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析，应用ClustalX、Mega 4.1 软件绘制进化树。
2结果与分析
2.1 RT-PCR检测结果
凝胶电泳检测，发现待检测样品扩增出一条180 bp的目的条带(如图1)，而阴性对照样品没扩增出条带，此次发病猪为HP-PRRSV毒株感染。
2.2 Nsp2和ORF5基因片段的扩增
Nsp2和ORF5基因扩增凝胶电泳结果显示Nsp2扩增出一条约为1 100 bp大小的片段(如图2A)，而ORF5扩增出一条约为564 bp大小的片段(如图2B)。
2.3 序列测定结果
将连接质粒测序后对序列进行拼接，将此次测序毒株命名为PRRSV SC-2016株。结果显示，Nsp2高变区序列长度为1 103 bp，ORF5序列长度为563 bp。分别将其与GenBank中收录的PRRSV毒株相应序列进行Blast比对。通过临近结合法(Neighbor-joining，NJ)分别构建SC-2016毒株及参考毒株的Nsp2和ORF5遗传进化树，并且从遗传进化树分支来看，SC-2016株属Hp-PRRSV亚型。
2.4 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因序列分析
系列分析结果表明：SC-2016毒株的Nsp2与GenBank中14种参考毒株的同源性在68.0%-83.1%之间(见图3)，其中与北京株(2007-EU106888.1)、甘肃株(2006-EU236259.1)、广东株(2007-EU880433.2)、甘肃株(2008-EU880437.2)、北京株(2006-EF112445.1)、武汉株(2013-HM853673.2)、河北株(2012-JQ326271.1)的同源性在82.0%～83.1%之间。与北京株(2006-EF112445.1)、甘肃株(2006-EU236259.1)、甘肃株(2008-EU880437.2)、河北株(2012-JQ326271.1)的同源性最高，达82.9%～83.1%。
SC-2016毒株ORF5与GenBank中14种参考毒株的同源性在87.9%～99.8%之间(见图4)，其中与北京株(2007-EU106888.1)、甘肃株(2006-EU236259.1)、广东株(2007-EU880433.2)、甘肃株(2008-EU880437.2)、武汉株(2013-HM853673.2)、河北株(2012-JQ326271.1)、北京株(2006-EF112445.1)的同源性均在98%以上。与武汉株(2013-HM853673.2)、河北株(2012-JQ326271.1)的同源性最高，达99.7%～99.8%。
2.5 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因遗传发育树分析
SC-2016毒株的的Nsp2和GenBank中收录的14种代表毒株ORF5基因序列绘制系统发生树，通过比较发现与北京株(2006-EF112445.1)、甘肃株(2006-EU236259.1)、河北株(2012-JQ326271.1)关系较近(见图5)。
SC-2016毒株的ORF5和GenBank中收录的14种代表毒株ORF5基因序列绘制系统发生树，通过比较发现与河北毒株(2012-JQ326271.1)关系较近(见图6)。
3讨论与分析
PRRS在20世纪80年代暴发以来，目前已成为危害世界养猪业的主要疫病之一，给整个养猪业造成严重的经济损失。主要引起母猪流产、早产、死胎，断奶仔猪生长迟缓，且常常继发其他病原感染。目前世界各国都在积极采取多种预防措施，但是该病在世界范围内仍陆续暴发，甚至出现了更多的高致病毒株系，PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，而不同毒株的 PRRSV具有不同的抗原性，从而造成本病更加难以控制。PRRSV感染猪群后，其发病临床特征和严重程度，取决于毒株、猪的年龄、继发其他细菌或病毒的感染情况。PRRSV毒株的毒力越强、感染猪的日龄越小、存在其他病原混合感染时，临床出现的病征就越严重，本场此次发生的PRRS疫情表现为发病猪临床病征较严重，鉴定结果表明此次感染毒株为高致病性蓝耳病毒株。
据资料表明，PRRSV通过碱基突变、缺失和基因重组发生变异，其中碱基突变最为多见。高志强等在2002年对HB-2(sh)毒株的全基因序列测定分析时首次发现PRRSV存在缺失变异现象，在NSP2和GP3基因上分别存在连续12个和1个氨基酸基因的缺失。越来越多的研究表明，PRRSV不同毒株的变异在整个基因组均有发生，但以Nsp2、ORF5变异程度最大。因此，很多学者根据ORF5基因的变异情况研究病毒的遗传演化规律。在所有结构蛋白中，Nsp2为各毒株间差异较大的一个编码区，变异程度最高，并具有种特异性，在各毒株间存在较大的差异，这也为主要毒株的新的分类方法提供了依据。此次对PRRS SC-2016毒株分别将其与GenBank中收录的PRRSV毒株相应序列进行Blast比对。并对SC-2016毒株及参考毒株分别构建了Nsp2和ORF5的遗传进化树。
根据遗传分析结果可知，PRRSV-SC-2016株的ORF5基因和Nsp2基因与2012年分离的河北毒株的亲缘关系最近。从遗传进化树分支来看，SC-2016株分属Hp-PRRSV亚型，基因分析表明四川眉山株的PRRSV病毒的变异度不大，在其生物学特性以及细胞嗜性、致病力等方面变化都不大。同时通过进化分析也发现，该病毒的序列略有变异，在日常防控工作中仍需加强PRRSV的监测，做好该病的分子生物学调查，分析研究该病原变异的趋势，对其致病机理和免疫机理进行深入研究分析，更加有效的根据变异提供有效的疫苗，以更好的防控该病。
