(二) 细菌鉴定

通过分离培养获得的病原菌，必须达到不含有其他微生物的纯培养程度，才能进行系统鉴定。系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生化特性、抗原性和病原性等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。微生物鉴定的程序通常是根据其形态、生长、生化特性等定种，最后根据抗原的免疫血清学检查定型。

1.形态学检查

各种细菌的形态在适宜的环境下是相对稳定的。但环境的改变，如培养基条件的改变，抗生素和化学药品的作用等，均可使细菌产生不规则的形态，并可出现细胞壁的缺陷和多样性。为此，在做细菌形态鉴定时，必须按被检菌的生长要求，选择适宜的培养基和培养条件以及适宜的培养时间和检查方法，才能作出正确的形态学鉴定。形态学检查如下。

1) 肉眼观察

肉眼观察主要观察细菌在固体、液体、半固体及鉴别培养基上的生长情况。在固体培养基上要观察菌落形态、大小、颜色是否均匀一致，表面是光滑湿润还是干燥无光或呈皱纹状，边缘是整齐还是不规则，菌落是隆起、扁平还是乳头样，是透明、半透明或不透明等。在液体培养基中，要观察培养基是否呈均匀浑浊，管底有无沉淀，液面有无菌膜，是否产气等。在半固体培养基上应观察细菌是否沿着接种线生长，是呈毛刷样生长还是均匀生长，上下生长是否一致。在鉴别培养基上，应观察其生长情况是否与预期的相一致，在血琼脂培养基上还要观察是否溶血及溶血环的特点，在某些培养基上还要注意是否有臭味等。

2) 显微镜观察

在做细菌个体形态学检查时，要根据被检菌的种类和检查项目，选用相应的染色方法，同时要注意选择适合的培养基以及细菌培养的时间，才能达到预期的目的。一般以18～24小时 (生长时间长的细菌除外) 的幼嫩培养菌为宜。例如，做革兰氏染色检查时，培养时间长的陈旧细菌可能由阳性变为阴性。做细菌运动性检查时，液体培养基的幼嫩培养物 (几小时到十几小时) 最为适宜。做鞭毛染色时，以液体培养基为宜。芽胞的形成，因细菌种类不同，对培养条件 (培养基、空气和培养时间) 的要求不同，但一般均要求较长时间。镜检时除注意其基本形态结构和大小 (要用测微计测量) 外，还应注意其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚膜等。必要时可用电镜观察其微细结构。

2.常用的几种染色方法

涂片用的载玻片需用清洁液洗净、擦干、不留油质，否则，培养物不能均匀地推开。被检材料如果是肉汤培养物，用铂金耳环取一滴，均匀涂抹于载玻片上，涂抹的范围约有手指甲大即可，随后，在酒精灯火焰上加热使之固定; 被检材料如果是固体培养物，先滴一滴水(常用生理盐水) 于载玻片上，用铂金耳环取少许培养物，在水滴中混匀，培养物不宜太多，否则，菌体看不清楚。脓汁、淋巴液、乳汁也按同样方法制备抹片。血液和病变组织直接涂抹在载玻片上，组织抹片也不能太厚，否则，不易观察菌体。细菌培养物抹片用火焰固定，而组织抹片用甲醇或甲醛固定。

1) 革兰氏染色法

(1) 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液染色1～2分钟，水洗。

(2) 加革兰氏碘溶液于抹片上作用1～3分钟，水洗。

(3) 用95%的酒精脱色约30秒至1分钟，水洗。

(4) 加稀释的石炭酸复红或沙黄水溶液复染10～30分钟，水洗。

(5) 吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

2) 美蓝染色法

在已干燥、固定好的抹片上滴加适量的 (足够覆盖涂抹点即可) 美蓝染色液，经1～2分钟，水洗，干燥 (可用吸水纸吸干或自然干燥，但不能烤干)，镜检。荚膜呈红色，菌体呈蓝色，异染颗粒呈淡紫红色。

3) 萋-尼 (Ziehl-Neelsen) 氏抗酸染色法

首先在已干燥、固定好的抹片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，在玻片下以酒精灯火焰微微加热至发生蒸汽为度 (不要煮沸)，维持3～5分钟，水洗。然后用3%盐酸酒精脱色，至标本无色脱出为止，充分水洗。再用碱性美蓝染色液复染约1分钟，水洗，最后吸干，镜检。抗酸性细菌呈红色，非抗酸性细菌呈蓝色。

4) 姬姆萨氏染色法

于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆萨氏染液原液，即成为姬姆萨染色液。抹片经甲醇固定 (一般需2～3分钟)，干燥后，在其上滴加足量染色液，或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟，或者数小时至24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检。荚膜呈淡紫色，菌体呈蓝色，视野呈红色。

5) 鞭毛染色法

染色液有： 甲液 (5%碳酸溶液10ml，鞣酸粉末2g，饱和钾明矾水溶液10ml) 和乙液(饱和结晶紫或龙胆紫酒精溶液)。

用时取甲液10份，乙液1份，混合后在冰箱中可保存7个月。在干燥、固定好的抹片上，滴加上述混合液，室温下染色2～3分钟，水洗，干后镜检。菌体和鞭毛均呈紫色。

6) 芽胞染色法

(1) 复红、美蓝染色法。抹片经火焰固定后，滴加石炭酸复红液于载玻片上，加热至产生蒸汽，经2～3分钟，水洗; 用5%醋酸褪色，至淡红色为止，水洗，以碱性美蓝液复染30秒，水洗，吸干或烘干，镜检。菌体为蓝色，芽胞呈红色。

(2) 孔雀绿、沙黄染色法。抹片经火焰固定后，滴加5%孔雀绿水溶液于其上，加热30～60秒，使之产生蒸气3～4次，水洗，以0.5%沙黄水溶液复染30秒，水洗，吸干，镜检。菌体呈红色，芽胞呈绿色 (酸处理过的载玻片，可防止绿色褪失)。

3.常用染色液的配制

1) 各种染料饱和酒精溶液的配制

配制染色液时，一般先将其配成能长期保存的饱和酒精溶液，使用时再稀释。将染料按其溶解度加于95%酒精中，贮存于棕色瓶中即可 (表1-2-6)。

表1-2-6 几种常用染料在95%酒精中的溶解度