摘要
目的：本试验通过犬细小病毒疾病模型的复制，考察注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型）对人工复制毕格犬细小病毒病的疗效。

方法：将所有发病毕格犬随机分为8组（5只/组）：（1）感染对照组；（2）辅助治疗组；（3）单独干扰素治疗组（40万单位/kg）；（4）低剂量干扰素治疗组（20万单位/kg）；（5）中剂量干扰素治疗组（40万单位/kg）；（6）高剂量干扰素治疗组（80万单位/kg）；（7）第二批次中剂量干扰素治疗组（40万单位/kg）；（8）第三批次中剂量干扰素治疗组（40万单位/kg）。

结果：第1组2只死亡；第2组1只死亡；第3组2只犬于给药治疗后第3天和第4天死亡；第4组5只犬中仅有1只犬于给药后第2天死亡；第5组与第6组的犬均于连续给药3-4天后出现明显好转；第7组和第8组的犬均于连续给药3-4天后出现好转。
结论：北京铁草科技有限公司生产的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型）皮下注射给药7天，同时结合对症治疗措施，可有效控制人工感染的毕格犬细小病毒病，改善临床症状，缩短疗程，显著降低死亡率；给药剂量以40-80万单位/kg的治疗效果最佳；疗效稳定，批次间无显著差异。

关键词：干扰素α；细小病毒；犬

1.引言

重组犬干扰素α突变体是具有高活性的新一代犬干扰素α产品。具有广谱抗病毒作用：抑制细胞内病毒复制和增殖，无论天然病毒，还是变异病毒都可有效抑制。且具有提高免疫力的作用，促进机体巨噬细胞、淋巴细胞和NK细胞的功能，可清除细胞外的病毒。可用于治疗犬病毒性疾病，如犬瘟热、犬细小病毒感染、犬腺病毒、犬副流感、犬冠状病毒感染、犬疱疹病毒感染、犬病毒性角膜炎等。

犬细小病毒病是20世纪70年代末发现的由CPV引起的一种急性接触性传染病。临床上以剧烈呕吐、出血性腹泻及高度沉郁为特征，主要危害幼犬（1岁内），发病率和死亡率都很高，但如果及时正确诊断，及时合理治疗，同时加强护理可以大大降低死亡率。目前常用的方法是在疾病早期应用干扰素或高免血清、单克隆抗体的同时，进行强心、补液、抗菌、消炎、抗休克等对症治疗。

2.材料与方法

2.1  试验材料

注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型），共三批次，20080101，20080301，20080401，由北京铁草科技有限公司提供。4℃保存备用。临床用前以灭菌生理盐水稀释后应用，现配现用。
其他试剂：各种培养基，细菌学检查用各种试剂，抗血清等。
犬细小病毒快速诊断试纸，北京世纪元享动物防疫技术有限公司。
胎猫肾传代细胞（FK81），由扬州大学畜禽传染病实验室保存。
实验器材：微生物分离、培养、鉴定用器材，显微镜等。

2.2 犬细小病毒种毒
毒株代号为CPV-2-2。来源：分离自扬州大学动物医院疑似感染犬细小病毒死亡犬的粪便，由扬州大学兽医学院预防兽医学教研室鉴定并保存。
2.2.1 毒力测定
按常规方法用猫肾细胞系（FK81）细胞测定犬细小病毒的组织细胞半数感染剂量（TCID50）。96孔板用含2 μg/ml胰蛋白酶的RPMI1640液洗细胞一遍后，逐孔加入10倍系列稀释的病毒液（10-1-10-7），50 μl/孔，每稀释度平行4孔，另设正常细胞对照，置37℃、5%CO2中吸附2h后弃去病毒液，换入RPMI1640液，继续孵育72h，观察CPE，根据Reed-Muench方法对病毒滴度进行计算。
2.2.2  病毒滴度测定

测定血凝价（HA）
① 猪醛化红细胞的制备
加枸椽酸钠作抗凝剂的无菌新鲜猪血，用5倍于红细胞压积的PBS（pH=7.2）充分洗涤5次，每次1500rpm 5-10min,直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀），再以相同缓冲液配制成25%红细胞悬液；25%红细胞与20%甲醛以2.5:1的比例混匀，37℃水浴作用2h；每15 min振荡一次，红细胞颜色由鲜红色转变为棕色；取出，以pH7.2 PBS洗涤4次，每次2000rpm 10 min，再加同样的PBS，制成25%红细胞；重复第三步醛化一次，同法洗涤；最后配制相当于20%醛化红细胞悬液，并加入0.01%硫柳汞防腐，分装，4℃保存备用。

② 血凝价（HA）的测定
将含有病毒感染的细胞悬液反复冻融3次后，在96孔V形板上用PBS按1∶2、1∶4、1∶8…等倍比稀释病毒原液，用1%的猪醛化红细胞作血凝试验，每孔加红细胞50 μL，以50%的红细胞凝集为终点，于4℃静止1h后判定结果：样品出现凝集终点的最高稀释度为HA滴度，同时设立红细胞对照。
2.2.3 种毒鉴定方法及结果

采用PCR法进行犬细小病毒种毒鉴定。
① PCR引物合成
本试验所用的引物参照文献合成，运用套式PCR：第一轮PCR反应用引物P1+P2；第二轮PCR反应用引物P1+P3。第一轮PCR扩增产物大小为1247bp；第二轮PCR扩增产物大小为746bp，引物的序列为：
P1：5'-TCCAgCAgCTATgAgATC-3'（3342-3360nt）
P2：5'-gATCTgTTggTAgCAATAC-3'（4570-4588nt）
P3：5'-gATCTgTTggTAgCAATAC-3'（4070-4088nt）
上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
② PCR模板DNA的制备
取疑有CPV感染的细胞悬液（产生CPE，对猪醛化红细胞有HA作用），反复冻融3次以充分裂解细胞。取500μL冻融后的细胞液，加入蛋白酶K至终浓度为500μg/mL，加入SDS至终浓为1%，充分混匀后，置55℃水浴作用30min。然后分别用Tris饱和酚（pH 8.0）、苯酚：氯仿（1∶1）各抽提一次，吸取水相，加1/10体积3mol/L NaAc（pH5.2）及2.5倍体积无水乙醇沉淀，置－20℃10min。12000rpm离心15min，沉淀用70%乙醇洗涤，晾干后悬浮于30μL含RNase A（20μg/mL）、无DNase的TE（pH 8.0）（RTE）中。
③ PCR反应
PCR反应体系（50μL）为：
10×Reaction buffer（with 15mmol/L MgCl2）　　5 μL
dNTPs（2.5mmol/L）　　　　　　　　　　　　 4 μL
引物P1（25μmol/L）　　　　　　 　　　　 　  1 μL
引物P2（25μmol/L）　　　　　 　　　　　 　  1 μL
DNA模板　　　　　　　　　　  　　 　　 　     2 μL
TaqDNA聚合酶　　　　　　　  　　　　　　     1 μL
超纯水　　　　　　　　　　　   　　　　　      36 μL
PCR反应参数：94℃，5min，然后94℃，30s，50℃，2min，72℃，2min，30个循环，最后72℃，10min。
④ 琼脂糖凝胶电泳
取PCR产物5 μL，加超纯水15 μL、6×loading buffer 4 μL混匀，3%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5 μg/mL）电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE（5.5g Tri·HCL，2.75g的硼酸，2mL 0.5M EDTA，加蒸馏水至1L），恒压80伏45min。

2.3 实验动物
55-70日龄未接种过犬细小病毒疫苗的毕格犬共40只，雌雄兼有，由扬州四方实验动物科技有限公司提供。接种病毒前观察7天。为避免肠道寄生虫对实验结果的影响，观察期间应用阿苯达唑进行驱虫（25mg/kg内服，每日一次，连续三次）。
饲养方式：引进动物前对饲养房间、用具全部以2%氢氧化钠溶液进行喷雾和浸泡消毒。每天饲喂2次，饲料为商品化狗粮，自由饮水。
符合试验条件的犬应临床表现健康，体温、白细胞总数等检查结果均正常。粪便以犬细小病毒快速诊断试纸进行检查，结果均为阴性。

2.4 疾病模型复制
除健康对照组以外，所有试验犬经隔夜禁食后，均每1kg体重肌肉注射0.2×10－7/100 μl TCID50的病毒（接种剂量经两次预试验确定）。
① 临床症状观察及剖检　接种后，每日两次观察临床症状（如精神状态、呕吐、腹泻、便血等），对表现异常的犬测肛温。对发病死亡犬进行剖检，重点观察小肠及肠系膜淋巴结的组织变化。
② 细小病毒快速诊断　根据发病情况和典型的临床症状初步诊断为犬细小病毒感染的犬，再用犬细小病毒快速诊断试剂盒进行确诊。以无菌棉拭子取病犬直肠粪便，加生理盐水约2mL，充分振动静置3min，吸取上清液加入试剂盒中，约5min后观察结果，呈现一条红线为阴性，两条红线为阳性。
③ 犬细小病毒的分离培养　取病死犬十二指肠或空肠内容物，加生理盐水及双抗，混匀静置后，上清液用滤器过滤（滤膜孔径为0.22 μm）除菌。将长成单层的FK81细胞用胰酶消化后按1∶2分瓶，取过滤好的上清按照约细胞培养上清量的1/3接种FK81细胞，同时设立阴性对照，37℃静置培养，24h后将细胞生长液（含10%小牛血清、30 μg/ml L-谷氨酰胺的DMEM）换成维持液（不含小牛血清、补加90 μg/ml L-谷氨酰胺的DMEM），逐日观察CPE，若经盲传3代后，产生CPE，则继续传代。
④ PCR检测　提取分离到的病毒基因组DNA，并以此DNA为模板，采取人工合成的正反引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定是否获得了预计长度的DNA片段（1247bp和746bp）。

2.5 实验动物分组及治疗

所有实验犬随机分为8组，每组5只。如表1。
其中干扰素分4个剂量治疗组：单独干扰素治疗组、低剂量组（20万单位/kg）、中剂量组（推荐剂量，40万单位/kg）、高剂量组（80万单位/kg），分别给予相应剂量生产批号为20080101的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型）。
第7组和第8组分别给予生产批号为20080301和20080401的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型），剂量为40万单位/kg。
根据临床出现症状，各犬均给予以下药物进行辅助治疗，纠正电解质紊乱和酸碱平衡措施，防止细菌性继发感染。
静脉滴注：复方氯化钠注射液（100ml），乳酸钠注射液（50ml），10％氯化钾注射液（1ml），庆大霉素注射液（3万单位），654-2注射液（0.8ml），VB6（1ml），VK3（1ml，仅出现血便时使用）。
肌肉注射：止血敏（1ml，仅出现血便时使用），安乃近注射液（0.8ml，仅出现高热时使用）。
口服给药：口服补液盐（13.95g）、安贝消食片(1片)、土霉素片（125mg）。
对辅助治疗组各犬仅采取每天1次的辅助治疗措施，单独干扰素治疗组仅给予每天一次的中剂量干扰素，其他干扰素治疗组犬，除给予相应剂量干扰素外，同时采取每天1次的对症辅助治疗措施。
各组发病犬除感染对照组外，均于出现呕吐、精神沉郁或腹泻症状时开始按表1给药治疗，给药疗程均为7天。干扰素给药途径为颈背部皮下注射。

2.6 观察项目
在接毒前、发病后治疗前及治疗后分别进行临床检查，观察项目包括精神状态、体温、饮食欲、呕吐、腹泻、粪便潜血等。

2.7 疗效判定标准
死亡率：凡在试验期间，出现犬细小病毒病的典型临床症状并死亡，病理解剖典型病理变化。取肠系膜淋巴结、小肠内容物，分离到犬细小病毒。其他原因致死者除外。根据因犬细小病毒感染死亡犬数计算各组的死亡率。
有效率：凡在试验期间，经给药后呕吐、下痢、便血停止，体温、心率、精神状况及食欲恢复正常，治疗结束后观察7天无异常者，判为有效，根据治愈犬占整组试验犬的比例计算有效率。

2.8 数据分析处理
用生物统计学方法进行数据的显著性检验。

3.试验结果及分析

3.1 犬细小病毒种毒毒力测定
代号为CPV-2-2的犬细小病毒毒株，按常规方法用猫肾细胞系（FK81）细胞测得其组织细胞半数感染剂量（TCID50）为10－7/100μl。

3.2 病毒滴度测定
以猪醛化红细胞测定犬细小病毒毒株CPV-2-2的血凝价（HA）为26。

3.3 种毒鉴定
以PCR法进行犬细小病毒毒株CPV-2-2的鉴定，结果表明，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，所设计的引物成功地扩增出了特异性的条带，大小约为1247bp和746bp，与预计的大小一致。

3.4 疾病模型复制
按每1kg体重肌肉注射0.2×10－7/100 μl TCID50的犬细小病毒剂量接种，大多数犬于接种后第6-8天开始出现临床症状，最初出现精神沉郁，喜卧，活动明显减少，排粪次数增加，粪便显黄色或灰黄色，稀如粥状，散发特殊的腥臭味，多数犬病初出现呕吐症状，呕吐物为白色粘液或泡沫，体温39.0-40.5℃。发病严重犬约1天后排粪呈喷射状，水样粪便，严重者粪便带血，呈淡红色或番茄酱样，混有黏液或伪膜。严重腹泻病犬迅速脱水，眼窝凹陷，皮肤弹性减退等。对发病死亡犬进行剖检，十二指肠及空肠黏膜严重出血，肠腔内有大量番茄样粪便，肠系膜淋巴结肿胀、出血。

取发病犬新鲜粪便用犬细小病毒快速诊断试纸进行实验室诊断,阳性率达95%（表2）。
取病死犬十二指肠或空肠内容物及肠系膜淋巴结，研磨制成10×乳悬液，冻融数次后离心，取上清接种FK81细胞，72h后，细胞出现圆缩、脱落，产生拉网现象，7只发病死亡犬均分离到犬细小病毒。提取病毒基因组DNA，并以此DNA为模板，采取人工合成的正反引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定是否获得了预计长度的DNA片段（1247bp和746bp），可确定为犬细小病毒毒株，表明成功复制犬细小病毒病的疾病模型。

3.5 治疗结果
各组发病犬除感染对照组外，均于出现呕吐、精神沉郁或腹泻症状时开始按表1给药治疗7天。
感染对照组5只犬中两只死亡，其他3只均出现消瘦、体质衰弱。
辅助治疗组各犬每天1次给予对症治疗，5只犬中，有一只犬于给药治疗后第3天死亡，其余4只均连续给药7天，至给药结束后第7天仍有2只犬未完全康复，表现为精神沉郁、食欲减退、体重下降。
单独干扰素治疗组各犬仅每天一次皮下注射给予中剂量干扰素（40万单位/kg），有2只犬于给药治疗后第3天和第4天死亡，死亡原因主要为剧烈腹泻导致脱水和肠道出血。
干扰素低剂量组5只犬除每天一次皮下注射给予20万单位/kg干扰素外，同时结合辅助治疗措施。5只犬中仅有一只犬于给药后第2天死亡。其他4只犬均于连续给药3天后出现明显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5-7天后均基本痊愈，至给药结束后第7天，精神、食欲恢复正常。
干扰素中剂量与高剂量组5只犬除每天一次皮下注射给予40或80万单位/kg干扰素外，同时结合辅助治疗措施。10只犬均于连续给药3-4天后出现明显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5-7天后均基本痊愈，至给药结束后第7天，精神、食欲恢复正常。
第7组和第8组分别给予生产批号为20080301和20080401的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型），剂量为40万单位/kg，同时结合辅助治疗措施。10只犬均于连续给药3-4天后出现好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5-6天后均基本痊愈至给药结束后第7天，精神、食欲恢复正常。

4.结论
由北京铁草科技有限公司生产的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型）皮下注射给药7天，同时结合对症治疗措施，可有效控制人工感染的毕格犬细小病毒病，改善临床症状，缩短病程，有效率达100%，显著降低死亡率，其治疗效果显著优于单独应用干扰素（有效率25%，死亡率50%）或仅辅助治疗组（有效率40%，死亡率20%）及感染对照组（死亡率40%）。
北京铁草科技有限公司生产的注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型）皮下注射给药，结合对症治疗时，给药剂量以40-80万单位/kg的治疗效果最佳。
为了考察产品批次间的稳定性，使用北京铁草科技有限公司生产的3批次注射用重组犬干扰素α突变体（冻干型），以40万单位/kg剂量皮下注射给药，均能有效控制人工感染的毕格犬细小病毒病，有效率100%，无死亡，疗效稳定，三批次产品间无显著差异。
与干扰素+辅助治疗各组相比，单独使用干扰素效果不理想，分析原因，是由于犬细小病毒病引起幼犬呕吐、腹泻而脱水、电解质紊乱、酸中毒、高热、出血等严重临床症状，不能得到及时控制而导致死亡，提示在临床应用该产品治疗犬细小病毒病时一定要配合辅助疗法，才能取得较佳的疗效，这已在4-8组的治疗中得到验证。

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