本部分重点研究恩诺沙星缓释注射剂在体内的药动学行为，以揭示该制剂在体内是否仍然具有缓释作用。本部分的研究工作采用高效液相色谱的分析方法，比较了家兔在肌肉注射恩诺沙星混悬注射剂，恩诺沙星乳化注射液、普通恩诺沙星注射液后药物在体内血药浓度经时过程，并用Kinetic4.4.1药物代谢动力学处理分析软件处理计算血药浓度经时曲线，分析比较各项动力学参数。

注射剂的安全性也是一项十分必要的研究工作，疗效好的药物制剂临床应用时也必须具有安全性的保障。因此本部分还通过局部刺激性实验来考察制剂的安全性。

1、仪器与材料

1.1.实验仪器

TGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂）；JI80-2B离心机（上海安亭科学仪器厂）；涡旋混合器（上海新芝生物技术研究所）；ShimaduLC-2010CHT（岛津公司）；

1.2.药品和试剂

普通恩诺沙星注射液（自制）；恩诺沙星混悬注射剂（自制）；恩诺沙星乳化注射液（自制）；正已烷（分析纯，南京化学试剂厂）；二氯甲烷（分析纯，南京化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；四丁基溴化铵（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；85%磷酸（分析纯，南京化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司）

所用水均为二次蒸馏水

1.3.实验动物

健康新西兰兔，体重约2kg，由青龙山动物饲养中心提供。

2、实验方法

2.1.方法学

2.1.1.HPLC色谱条件

色谱柱：Platisil  ODS 5U 250*46mm,Dikma

流动相：甲醇-0.005mol/L 四丁基溴化铵水溶液（20：80VV）,85%磷酸调PH=3；

流速：1ml/min

紫外检测波长：275nm

柱温：25℃

进样体积：20ul

2.1.2.血浆样品处理方法

2.1.2.1.沉淀法[1]

取家兔血浆0.4ml置2mlEP管中，加入1ml乙腈，于涡旋混合器上涡旋振荡1min,10000r/min 离心10min,取上清液1ml移至挥干管中，在40℃水浴下N2挥干。然后用100ul流动相复溶，涡旋振荡2min后转移至EP管中，10000r/min离心10min，取上清液20ul进样。

2.1.2.2碱化蛋白法[2]

取家兔血浆0.4ml置10ml带塞离心管中，加入0.5ml 0.1M氢氧化钠溶液，于涡旋混合器上涡旋振荡1min，再加入5ml二氯甲烷，涡旋振荡5min,3000r/min离心10min，取上清液4.5ml移至挥干管中，在40℃水浴下N2挥干。然后用100ul流动相复溶，涡旋振荡2min后转移至EP管中，10000r/min离心10min，取上清液20ul进样。

2.1.2.3萃取法[3]

取家兔血浆0.4ml置10ml带塞离心管中，再加入正已烷-二氯甲烷（1：1，V/V）混合溶剂5ml,于涡旋混合器上涡旋振荡5min,3000r/min离心10min,取上清液4.5ml移至挥干管中，在40℃水浴下N2挥干。然后用100ul流动相复溶，涡旋振荡2min转移至EP管中，10000r/min离心10min，取上清液20ul进样。

2.1.3.专属性考察

取空白家兔血浆0.4ml，按萃取法处理血浆，分别取空白血浆、空白血浆外加药物及家兔肌肉注射给药后的血浆样品进样。

2.1.4.标准曲线的制备

取带塞离心管，精密加入不同浓度的恩诺沙星标准品溶液0.4ml,40℃水浴下N2挥干，加入家兔空白血浆0.4ml，使血浆中恩诺沙星的浓度分别为0.05，0.1，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1，1.999，2.999ug/ml,随后按萃取法处理血浆，以血浆中样品的浓度（C）为横坐标，样品峰面积Aⅰ为纵坐标作线性回归，得拟生物样品标准曲线方程。

2.1.5.回收率

取带塞离心管，精密回入不同浓度的恩诺沙星标准品溶液0.4ml，40℃水浴下N2挥干，加入家兔空白血浆0.4ml，使血浆中恩诺沙星的浓度分别为0.05，0. 6，3ug/ml,其余按萃取法处理血浆。代入标准曲线计算测得量，计算方法回收率。进样测得恩诺沙星的峰面积A；另取流动相配制等浓度的恩诺沙星标准溶液直接进样得峰面积A，，将两峰面积相比即得萃取回收率。

2.1.6.精密度

取带塞离心管，精密加入不同浓度的恩诺沙星标准品溶液0.4ml,40℃水浴下N2挥干，加入家兔空白血浆0.4ml，使血浆中恩诺沙星的浓度分别为0.05，0. 6，3ug/ml,其余按萃取法处理血浆，以药物峰面积为指标，测定日内和日间的变异。

2.1.7.最低定量限

配制恩诺沙星血浆中浓度分别为10、30、50ng/ml的样品溶液，按萃取法处理血浆，每种浓度的血浆样品进样三次，记录色谱图，以信噪 比为10：1为标准，达到此标准的血浆中药物的最低浓度为最低定量限。

2.2.药动学实验

2.2.1.实验制剂和参比制剂

实验制剂为恩诺沙星混悬注射剂，恩诺沙星乳化注射液；参比制剂为普通恩诺沙星注射液。

2.2.2.给药剂量5mg/Kg

2.2.3.给药方法

取三只健康家兔，称重，采用三周期三交叉设计安排实验（具体见Tab.4-1）,每周期间隔2周，分别给予恩诺沙星混悬注射剂，恩诺沙星乳化注射液，普通恩诺沙星注射液，给药前禁食过夜，经家兔左后腿股四头肌肌肉注射。